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酶 分 析 法 教学目的和要求 熟悉： 1．酶活力的测定方法 2．酶法分析的测定方法 了解：酶分析法的原理 概 述 1.酶的概念是生物体内产生并具有催化活性的一类蛋白质，由于表现出特异的催化功能，因此酶被称为生物催化剂。 2.酶的应用：在体外进行催化反应 ①用以制造某些产品 ②用以去除某些物质 ③用以识别某种化合物 属于“酶分析法” ④用以测定某种物质 酶是由活细胞产生的具有催化作用的特殊物质，又称生物催化剂。 除极个别RNA为催化自身反应的酶外，其余所有的酶都是蛋白质。 生物体内一切生化反应都需要酶的催化才能进行！ 性能远远超过人造催化剂。 产物（product，P） 底物（substrate，S ） 酶 的 概 念 酶是特殊的催化剂 (1) 生物大分子 (2) 催化条件温和 (3) 强酸、碱或高温下失活 (3) 高选择性 (4) 高催化效率 机理：降低反应活化能，提高反应速度，不改 变平衡点。 只起催化作用，本身不消耗。 酶 的 特 点 概 括 如 下 ： 概 述 3.酶分析法包括两种类型： 一是以酶作为分析对象，这类分析方法称为“酶活力测定”。 二是以酶作为分析手段，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，通常将这类分析方法称为“酶法分析”； 4.两类酶分析法的区别 相同：从原理到方法 不同： 酶活力测定法中，是以酶为分析对象。使用的底物应该过量。 酶法分析中，是以酶为分析工具或分析试剂,被检化合物（如：底物）是反应的限制因素 酶法分析的优点 1 用于复杂组分中结构或物理化学性质比较相近的同类物质的分离鉴定和分析。 2 特异性强、干扰少、操作简单、样品和试剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特点。 3 通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能发生的干扰反应并设法纠正。 4 可用偶联反应。 5 无污染或污染很少的分析方法。 共同点：原理和方法相同，以酶的专一高效催化某化学反应为基础，通过测定酶反应的速率或生成物浓度来检测相应物质的含量。 酶法测定的原则 1、酶活性的测定 2、代谢物浓度的测定 3、酶底物复合物 酶反应动力学 1、米氏方程 1）. 米氏方程 Km 即为米氏常数， Vmax为最大反应速度 当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = [S] 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。 因此,米氏常数的单位为mol/L。 2、Km米氏常数意义及推导过程 不同的酶具有不同的Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。 计算题 要求酶按其最大反应速度的99%的速度进行反应，求所需底物浓度［S］。 已知［S］＝9Km,求该酶体系的反应速度为何值？ 过氧化氢酶的Km为2.5×10－2mol/L，当底物浓度为100mmol/L时，求反应速度达到最大速度的百分数？ 第一节 酶活力测定法 一、基本概念 二、酶促反应的条件 三、酶活力的测定方法 四、测定过程中应注意的问题 一、基本概念 1.酶活力：指酶催化一定化学反应的能力。 2.酶活力的测定：是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。 3.酶活力测定的目的：通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量 酶活力(enzyme activity)的测定 1．酶活力 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力， 酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，酶催化的反应速率愈大，酶的活力愈高；反应速率愈小，酶的活力就愈低。两者呈线性关系。 所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速率。 酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。 在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。 V = [p] / t [p] = v t 引起酶促反应速率降低的原因 (1)底物浓度的降低； (2)产物浓度增加加速了逆反应的进行； (3)产物对酶的抑制或激活作用 (4)随着时间的延长引起酶本身部分分子失活等。 因此测定酶活力，应测定酶促反应的初速率，反应初速率与酶量呈线性关系，因此可以用初速率来测定制剂中酶的含量。 检验酶反应和测定系统是否适宜的标准 测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系 一、基本概念 4.酶反应的速度：用单位时间内反应底物的减少或产物的增加来表示，酶反应的速度愈快所表示的酶活力愈高。 5.测定酶活力的方法：可用物理法、化学