疫苗中支原体的检测要点.ppt

疫苗中支原体的检测 11级生技母若雨 指导教师：张丽娇 主要内容 1.支原体 2.支原体的危害 3.支原体的检测方法 1.支原体 又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。其大小介于细菌和病毒之间。可通过滤菌器，常给细胞培养工作及发酵和制药灭菌带来污染的麻烦。一般能以葡萄糖或精氨酸为主要碳源。 2.支原体的危害 3.1培养法 推荐培养基及其处方 （1）支原体肉汤培养基 猪胃消化液500ml 氯化钠2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚红0.02g pH值7.6±0.2于121℃灭菌15分钟。 （2）精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚红0.02g 氯化钠2.5g pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （3）支原体半流体培养基 按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加 入琼脂2.5～3.0g。 （4）支原体琼脂培养基 按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入 琼脂13.0～15.0g。 培养基灵敏度检测 （1）菌种肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714），由国家药品检定机构分发。 （2）操作 将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3 支试管，置36 ℃ 士1 ℃ 培养7 ～14 天，观察培养基变色结果。 ( 3 )结果判定 以接种后培养基管数的2 / 3 以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531 ) 应达到10-8 ，口腔支原体（ATCC 23714 ）应达到10-4。 培养基处理 检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10 ～15 分钟，冷却至56 ℃ 左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2 ) ，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 接种培养 取每支装量为10ml 的支原体半流体培养墓（已冷至36 ℃ 士1 ℃ ）和支原体肉汤培养基各4 支，每支培养基接种供试品0.5 ～1.0ml ，置36 ℃ 士1 ℃ 培养21 天。于接种后的第7 天从4 支中取2 支进行次代培养，每1 支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2 支，置36 ℃ 士l ℃ 培养21 天，每隔3 天观察1 次． 结果判定 培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长， 则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。 3.2指示细胞培养法（DNA染色法） 实验试剂制备 （1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液 称取二苯甲酰胺荧光染料5mg ，加人100ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hank s 平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30～40 分钟，使完全溶解，-20℃ 避光保存。 （2）二苯甲酰胺荧光染料工作液 无酚红和碳酸氢钠的Hank s 溶液100ml 中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml ，混匀。 （3）固定液 醋酸:甲醉（体积比1:3 ）混合溶液。 （4）封片液 量取0.1mol / L 枸橼酸溶液22.2ml 、0.2mol / L 磷酸氢二钠溶液27.8ml 、甘油50.0ml ，混匀，调pH 值至5.5 。 培养基及指示细胞处理 （1） DMEM 完全培养基。 ( 2 ) DMEM 无抗生素培养基。 ( 3 )指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞） 取培养的Vero细胞经消化后，制成每lml 含105 的细胞悬液，以每孔0.5ml 接种6 孔细胞培养板或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3ml ，于36℃ 士1 ℃ 、5 ％二氧化碳条件下培养过夜，备用。 供试品处理 （1）细胞培养物 将供试品经无抗生素培养液至少传1 代，然后取细胞已长满的且3 天未换液的细胞培养上清液待检。 （2）毒种悬液 如该毒种对指示细胞可形成病变并影响