小鼠骨髓染色体制片技术要点.pptVIP

湖州师范学院 生命科学学院生物系 一、实验目的 1、了解动物细胞染色体制片的原理； 2、学习小鼠骨髓细胞染色体的制片方法； 3、观察小鼠细胞染色体的数目和形态。 二、实验原理 ※制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。 ※染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。 二、实验原理 ※小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。 ※骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。 ※对大型动物通常采用对骼骨、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。 三、实验材料 小白鼠（2n=40） 五、实验步骤 1、前处理 为提高有丝分裂的指 数，增多细胞中期分 裂相。提前3-4小时 向小鼠腹腔内注射0.02 —0.04%秋水仙碱溶液。 每10g体重注入0.1ml 五、实验步骤 7、固定：弃上清，沿管壁加5～8ml固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），吹散打匀，37℃静置20min。用吸管对细胞悬液再次吹打均匀（水浴中），继续37℃静置20min。 8、离心： 1000r/min离心10min。 9、制细胞悬浮液：弃上清，留约0.1～0.2ml的沉淀细胞和上清液，用吸管反复轻吸混匀，制成细胞悬液。 七、作业、思考题 八、参考文献 * 《遗 传 学》校 级 精 品 课 程 《遗 传 学》校 级 精 品 课 程 《遗 传 学》校 级 精 品 课 程 四、实验仪器设备药品 ※离心机、显微镜、恒温水浴锅、天平、剪刀、解剖刀、镊子、注射器及针头、刻度离心管、吸管、载玻片和盖玻片。 ※ 0.02—0.04%秋水仙素，2%柠檬酸钠溶液，0.075mol/L KCl，甲醇，冰醋酸，1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=6.8），Giemsa原液 2、取股骨：带手套，拖颈椎法处死 小鼠，剖出股骨。 五、实验步骤 五、实验步骤 2、取股骨：剖出股骨，剔净股骨上的 肌肉。 五、实验步骤 2、取股骨：剖出股骨，剔净股骨上的 肌肉，用2％柠檬酸钠溶液洗净。 五、实验步骤 3、取骨髓细胞：剪去股骨两端，用注射器吸取2％柠檬酸钠溶液1ml，将针头插入骨髓腔，慢慢注射，将骨髓细胞冲入离心管（骨髓细胞液）反复吹洗直至骨腔变白。 五、实验步骤 4、离心：骨髓细胞液1000r/min离心10 min。 5、低渗：弃上清，加0.075mol/L KCl5～8ml吸管打匀，37℃恒温箱(水浴锅)净置35 min（中间吹打1次）。 6、离心：1000r/min离心10min。 五、实验步骤 10、滴片：取冰箱中预冷的洁净载玻片， 30°倾斜，用吸管吸取一滴上述细胞悬液，于载玻片上适当高度滴在载玻片上，立即吹散吹匀细胞，扩散平铺于玻片上，空气中自然干燥。 11、染色、水洗：载玻片充分干燥后，用Giemsa染色液（pH6.8的磷酸缓冲液按1份Giemsa 原液9份磷酸缓冲液混匀）染色。材料面向上，用染液覆盖载玻片，染色10～15min，用流水洗去多余染液(材料面向下)，再用吸水纸吸干多余水分。 12、镜检：干燥后即可镜检。 五、实验步骤 1．在低倍及中倍镜下观察Giemsa染色之后的染色体制片，寻找分散适当的中期染色体图象。 2．在高倍镜下进行仔细观察，熟悉小鼠染色体的形态，统计染色体数目。 注意观察：在高倍显微镜下小鼠骨髓细胞的染色体类型？两条单体分开呈现的形态？。 六、实验结果 小鼠骨髓细胞中期分裂相图 六、实验结果 1.交实验报告，绘制显微镜下染色体图象。 2.KCl溶液低渗处理与滴片过程，对制片结果 各有何影响？ 3.骨髓细胞染色体标本制作时，为什么要采用 冰片滴片？ 冰片滴片时滴液高度有什么要求？为什么滴片后要马上吹散？冰片温度为什么越冰越好？