第7章发酵工程制药(二)总结.ppt

第九节  基因工程在发酵工程中的应用 以天然产物为基础发展药物的方法 基因工程改造传统制药工业体现在四个方面 一、基因工程在抗生素生产中的应用 微生物基因工程育种 （一） 抗生素生物合成基因的特点及其克隆的策略和方法 阿克拉霉素Aclacinomycin 7个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因簇的方法，利用这些策略已经克隆了不同类型抗生素的生物合成基因。这7个方法是： 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 阻断变株法 突变克隆法 直接克隆法 克隆抗生素抗性基因法 寡核苷酸探针法 同源基因杂交法 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 放线紫红素阻断突变株之间的互补测验 【突变克隆法原理图解】 （二） 几种典型的抗生素生物合成基因簇的结构 抗生素生物合成是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成是一个复杂的，多因素的调节过程，抗生素的生物合成基因簇构成了对抗生素产生的最低水平的调节和控制。 放线紫红素 红霉素 青霉素 链霉素 （三） 提高抗生素的产量 （三） 提高抗生素的产量 （三） 提高抗生素的产量 （三） 提高抗生素的产量 生物合成途径中某个酶基因的突变 在生物合成途径中引入一个酶基因 利用底物特异性不强的酶催化形成新产物 有针对性地对某些基因进行操作，如替换、阻断、重组等均有可能改变其生物合成途径而产生新的代谢旁路，形成新的化合物。 组合生物合成的基本过程是将不同来源的基因组合，在异源宿主细胞中进行基因表达，将宿主细胞产生的化合物分离提纯，对化合物的结构进行解析，推测生物合成规律。 组合生物合成的特点 二、基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用㈠ 在氨基酸生产中的应用 赖氨酸和苏氨酸协同反馈抑制 互补试验原理图示 顺反效应（cis-trans effect） 顺反测验图解 2、增加参与生物合成中的限速阶段基因的拷贝数 反馈抑制(feedback inhibition)是生物合成限速反应的实质，一般是终产物对合成反应某个环节发挥作用的酶活力的抑制，这个环节就是“限速瓶颈”，被抑制的酶就是“限速酶”。 增加酶基因的拷贝数以提高限速酶的的浓度是增产的基本措施； 天蓝链霉菌十一烷基灵红菌素的生物合成最后一步的0-甲基转移酶、泰乐星生物合成的最后一步的0-甲基转移酶，增加这个酶基因的拷贝数可以提高终产物的产量。 异青霉素合成酶(Isopenicillin N Synthetase, IPNS)的基因与酰基转移酶基因紧密连锁，可能是青霉菌(Penicillium sp.)青霉素生物合成的限速酶； 青霉素N做为头孢菌素C的中间产物，它的积累使头孢菌素C产量下降。说明扩环酶基因cefEF属于限速酶 ； 3、发挥调节基因的作用 抗生素生物合成基因簇中存在调节基因，以精细调节整个基因簇成员的表达强度； 增加正调控基因拷贝数可以增加抗生素的产量； 降低负调控基因的活性也可以提高抗生素的产量； 天蓝色链霉菌(S. colicolor)的放线紫红素(actinorhodin)生物合成基因簇成员act Ⅱ的四个ORFs都是调控基因，对act Ⅰ、act Ⅲ和其它基因起正调控作用；增加act Ⅱ的剂量可以使放线紫红素产量提高20-40%。 act Ⅱ(编码聚酮合成酶 ketosynthase, KS和链长决定子 chain length determining, CLF) ；act Ⅲ (编码酮基还原酶 ketoreductase, KR) 4、增加抗性基因的拷贝数 有些抗性基因本身就是抗生素生物合成基因簇成员，甚至做为一个合成环节参与抗生素的生物合成； 抗性基因先于生物合成基因表达，即在建立抗性后，抗生素生物合成基因才能表达、合成抗生素； 抗性基因表达的强度和体现的抗性水平与抗生素合成水平呈现平行关系：如果提高抗性水平就可以提高抗生素合成水平； 氨基糖苷类抗生素抗性基因aacA(编码6’-N-氨基糖苷乙酰转移酶)，增加这个的拷贝数可以提高新霉素和卡那霉素的生物合成量； 1、将产生菌基因随机克隆到原菌株直接筛选高产菌株 2、增加参与生物合成种限速阶段基因的拷贝数 3、发挥调节基因的作用 4、增加抗性基因的拷贝数 提高抗生素的产量的主要措施 （四）改善抗生素组分 许多抗生素产生菌可以产生多组分抗生素，由于这些组分的化学结构和性质非常相似，而其生物活性却相差很大，这给有效组分的发酵、提取和精制带来很大不便。 应用基因工程方法可以定向地改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种。 用阿维菌素B2a生产伊维菌素，产同时产生8个组分，4个主要组分A1a、A2a、B1a、B2a和4个次要组分A1b、A2b、B1b、B2b。A与B组分的区别在于C-5的羟化基因上是否连有甲基，这是由5-O-甲基转移酶基因（aveD）决定。 选育只产生阿维菌素B2