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第十二章 酶技术 专业：发酵工程 第一节 酶生物合成的调节技术 操纵子学说（雅格和莫诺德，1960年） 酶的生物合成是在基因的控制之下进行的。这些基因包括调节基因（regulator gene）、启动基因（promoter gene）、操纵基因（operator gene）和结构基因（structural gene）。他们在DNA分子中按一定的次序排列，启动基因、操纵基因和结构基因一起被称作操纵子（operon）。 调节基因：可以产生一种阻遏蛋白。 启动基因：决定酶的合成能否进行。 操纵基因：可以与调节基因产生的阻遏蛋白结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速率。 结构基因：决定合成某一种蛋白质或RNA分子结构相应的一段DNA。 （一）酶合成的诱导 通过添加某种物质，可使酶的合成开始或加速进行，这种作用称为诱导作用。能够引起诱导作用的物质称为诱导物。 如：乳糖酶的诱导 1 诱导物的选择 诱导物可分为三类 (1) 酶的作用底物 如：大肠杆菌生产β-半乳糖苷酶 (2) 酶的反应产物 如：纤维二糖对纤维素酶有诱导能力 (3) 酶的底物类似物(最有效的诱导物) 如：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对β-半乳糖苷酶的诱导 2 酶诱导合成的条件 (1) 基因必须完整。酶的合成是在基因的控制下进行的， 若基因受到破坏或变异，酶的合成将受影响。 ① 若酶所对应的结构基因改变，该酶将无法合成。 ② 若同一操纵子中，第一位的结构基因受破坏，则第二位及其以后的各个结构基因及时完好，也无法合成相应的酶。 ③若操纵基因变异，将出现两种相反的情况：一是操纵基因变异后，阻抑蛋白不能与之结合，那么将不受诱导物或阻遏物的影响，酶都可以合成；二是操纵基因变异后，与阻抑蛋白牢固结合，是否有诱导物，酶均无法合成。 ④若调节基因变异，不能合成相应的阻抑蛋白，那么也不受诱导物 或阻遏物的影响。 (2)阻抑蛋白本来与操作基因的亲和力强，两者原来结合在一起，使酶不能合成。当添加诱导物时，诱导物与阻抑蛋白结合，使其与操作基因分离，才能进行酶的合成。 (3)在添加诱导物时，细胞处于环境中，不能有高浓度的分解代谢阻遏物或其他强阻遏物存在，否则将无法诱导。（如乳糖和葡糖糖） 3 酶诱导合成的检测 (1)胞外酶：在诱导一定时间后，每隔一定的时间取一定量的培养基连同细胞一起测定酶活力，同时测定细胞的量。计算单位细胞量的酶活力，再与不添加诱导物的数值对照，可知诱导效果如何。 (2)胞内酶：在添加诱导物后，每隔一定的时间取一定量的细胞，破碎，测定酶活力，算出单位细胞量的酶活力。与不添加诱导物的数值对照，可知诱导效果如何。 二、酶生物合成的阻遏 1 阻遏作用的分类 酶生物合成的阻遏作用有产物阻遏和分解代谢阻遏 （1）产物阻遏作用 产物阻遏是由于产物与阻遏蛋白结合后，使原来不与操作基因结合的阻遏蛋白变构，而与操纵基因结合在一起，使酶的合成受阻。 如：色氨酸操纵子酶阻遏（图） (2)分解代谢物阻遏作用 分解代谢物阻遏作用是指某些物质(主要是指容易利用的碳源)经过分解代谢产生的分解代谢物阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成的现象。 分解代谢物阻遏作用与环腺苷酸（cAMP）的浓度有关。如下图 2 酶合成的阻遏与解除阻遏作用 (1)使酶的合成受阻 在细胞进行酶合成的过程中，添加一定量的阻遏物，如：末端产物、反应产物或葡萄糖等容易利用的碳源。 (2)使酶合成的阻遏作用解除必须除去阻遏物，控制阻遏物的含量或添加cAMP. 3 酶阻遏作用与解除阻遏合成的检测 方法一：在酶合成的过程中，添加不同量的阻遏物，然后每隔一段时间，取样分析酶活力和细胞量，与空白试验进行对照，即可检测该物质的阻遏效果。 方法二：将细胞从含有阻遏物的培养基中取出，洗净后，重新在含有阻遏物和不含阻遏物的培养基中培养，再比较两者的酶活力和细胞量，亦可检测阻遏物的阻遏效果，并看到解除阻遏合成。 第二节 酶反应动力学的研究 一、酶反应初速度的测定 酶催化反应速度：用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。一般多采用单位时间内产物的增加量来表示。 测定酶反应速度的步骤： (1) 根据酶的催化专一性，选择适宜的底物； (2) 根据文献资料或初步试验结果，确定酶反应的温度和pH条件，温度亦可选在25℃ (3) 在一定条件下，将一定量的酶液加到底物中，开始反应，记录时间。 (4) 每隔一定时间，取出适量的反应液测定产物生成量 或底物减少量。时间间隔开始阶段可以短些，后期可 间隔长些。 (5) 以反应时间为横坐标，产物生成量或底物减少量 为纵坐标作出酶反应过程曲线。 二 底物浓度对反应速度的影响 Km和vmax的测定 如果根据上图求