铁皮石斛组织培养栽培试验实验要点.docVIP

铁皮石斛茎段组织培养与栽培 摘 要: 为试验铁皮石斛茎段组织培养与栽培，以铁皮石斛茎段为外植体，结合铁皮石斛的生物学特性，综述铁皮石斛组织培养与栽培的过程技术。观察研究基本培养基、天然附加物和植物生长调节剂对铁皮石斛生长的影响。验证和探究铁皮石斛茎段组织培养技术并对铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术进行了思考与展望。 关键词: 铁皮石斛; 组织培养; 茎段; 移栽; 驯化 0.引言 铁皮石斛 ( Dendrobium officinale Kimura et Migo) 是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw．)多年生草本植物，又名黑节草，俗称铁皮枫斗，分布于云南、安徽、贵州、浙江、江西、广东和广西等地，是我国传统名贵珍稀中药材，其有效成分主要为石斛多糖、石斛碱、氨基酸等，其中石斛多糖的含量高达21.7%，能显著提高机体免疫功能，具有养胃出津、补肾益力、滋阴清热、耐缺氧、抗疲劳、抗肿瘤等功效。现代药理学研究发现，石斛还具有抗衰老和扩张血管的作用。 铁皮石斛喜荫凉、湿润的环境，常附在高海拔悬崖峭壁或林内树干和岩石缝隙中。由于其药用价值高、生长条件特殊和分布受局限，且经长期人为采挖，野生资源濒临灭绝。铁皮石斛是2005版《中华人民共和国药典》收载的3种石斛属植物之一，为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低，是一种珍稀的药用植物和和名贵的室内观赏植物.。铁皮石斛自然繁殖力极低, 常规繁殖又较困难, 且多年来对铁皮石斛的采集量远大于其生长量, 野生铁皮石斛自然繁殖已濒临绝迹。由于药用价值高，人为的过度开采与生态破坏，野生铁皮石斛已濒临灭绝，1987年国务院将其列为国家重点保护植物。 1 材料与方法 1. 1 试验材料 野生云南铁皮石斛，取材于浙江农林大学组培实验室，取其茎段作为外植体进行组织培养。 1. 2 试验方法 1. 2. 1 外植体消毒 取铁皮石斛的茎，去除多余叶片后用解剖刀将茎切成含 3 ～ 4 个节点的茎段，保留节点。依次用中性洗涤剂清洗，自来水冲洗 20min，用 70% 的乙醇浸泡 10 ～ 60 s，再转入 0. 1% 的氯化汞中，灭菌 5 ～11 min 后倒去氯化汞溶液，用无菌水反复漂洗材料 3-5 次。用无菌纸吸去茎段上多余水分，将其切成 1 ～2 cm 带一个芽点的茎段，接种到培养瓶中培养。 1. 2. 2 培养基制备 铁皮石斛培养基均添加 3% 蔗糖，0. 7% 琼脂，pH 值为 5. 8。按不同目的在基本培养基中加入 6-BA、NAA、IBA，每个培养瓶分装 50 m 培养基，密封。经过 121 ℃高温灭菌 25 min。不定芽的诱导培养基是在基本培养基 MS 中加入细胞分裂素和生长素，采用不用浓度水平的 NAA 和6-BA。组培苗的壮苗与生根，将生长状态稳定的试管苗接种于添加不同激素组合的 1/2 MS 培养基上。 (1)诱导培养基: ①MS+6-BA0.5mg／I。+NAA 0.05mg／L+AC(活性炭)29／L； ②MS+6-BAl．0mg／L+NAA0．1mg／L+AC29／L。 (2)增殖培养基: 花宝3号39／L+6一BA2．5mg／L+NAA0．25mg／I。+AC29／L。 (3)生根培养基:1／2 MS+IBA0．5mg／L+AC29／L。培养基中添加蔗糖209／L，pH5．2～5．4 1. 2. 3 培养条件 接种铁皮石斛培养材料的组培苗在组织培养室中培养，培养温度为 ( 26 ± 2) ℃，光照 14 h/d，光强1 500 ～ 2 000 lx。 1. 2. 4诱导培养 用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基①中进行培养。15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织。继续培养20天后，转入培养基②中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物。 1. 2. 5增殖培养 将诱导形成的原球茎转入到增殖培养基中，原球茎增殖速度很快，增殖倍数可达3～4倍，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行。 1. 2. 6 生根培养 取诱导形成的不定芽，要求芽高2 ～3 cm，带3 ～5片叶的不定芽，将其接种到不同处理的生根培养基上，进行培养。培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根，随后逐渐伸长，生根率达到90％以上。 2.移栽与驯化 2.1移栽前的准备 2.1.1炼苗 当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可炼苗。移栽前先将瓶苗至炼苗房进行2~3周的炼苗，让瓶苗从封闭稳定的环境向开放变化的环境过渡，慢慢适应自然环境，等瓶苗生长健壮、叶色正常