同种异体骨移植修复过程中转化生长因子β1表达的实验研究要点.pptVIP

现已证实，TGF-β1可诱导间充质细胞向成软骨细胞、成骨细胞转化， 以软骨内成骨或膜内成骨的方式成骨。 本研究观察到，异体骨移植成骨过程主要是以膜内成骨方式进行，软骨内成骨很少。 原位杂交结果显示，在膜内成骨阶段TGF-β1mRNA表达量最高，随即呈现出下降趋势。 这可能是骨移植时局部出血较少，有氧环境利于间充质细胞向成骨细胞转化，以膜内成骨的方式形成骨组织。这与骨折愈合过程中， 局部TGF-β1mRNA的表达特征明显不同，即没有与软骨内成骨阶段有关的第二次峰值出现。 二、免疫排斥反应抑制TGF-β1的表达 本研究表明，主要组织相容性抗原不配的同种异体骨移植的成骨效果明显不如组织抗原相配者。原位杂交结果也显示出同样的抑制特征。这说明供受体间主要组织相容性抗原不配抑制骨移植的修复过程以及局部内源性TGF-β1的表达。这一结论与以往研究结果是一致的。 研究证明，骨细胞膜及细胞外骨基质中含有大量I、II类抗原分子。异体骨移植可以呈递抗原，诱发宿主产生以局部细胞免疫反应为主的排斥反应，导致移植骨周围炎性细胞浸润，毛细血管狭窄、闭塞，移植骨修复过程延迟或移植骨被超前吸收。 * * 同种异体骨移植修复过程中转化 生长因子β1表达的实验研究 梁炳生 关海山 山西医科大学第二医院骨科 前 言 转化生长因子β1（ TGF-β1）是一种多肽类多功能生长因子，可以调节多种细胞或瘤细胞的生长分化，在骨组织中受损伤刺激可启动新生骨与软骨的生成。动物实验证明，外源性TGF-β1能够促进骨折愈合。目前认为，TGF-β1表达量的变化可直接反映成骨能力的强弱，其基因表达信号的强弱可反映生成量的多少。 本研究采用免疫组化和原位杂交方法，观察分析同种异体骨移植修复过程中，术后时间、移植骨处理以及供受体间主要组织相容性抗原是否相配等因素对移植骨局部内源性TGF-β1表达的影响，旨在为进一步研究异体骨移植愈合机理以及临床合理使用重组生长因子提供实验依据。 材料与方法 本研究采用2×2×4三因素析因试验设计方法。根据供受体间主要组织相容性抗原是否相配将实验动物随机分为两个大组，即主要组织相容性抗原相配组和不配组。各大组再随机分为两个处理组，分别是新鲜异体骨移植组和冷冻异体骨移植组。 一、实验设计 表1：实验动物分组情况及处理 二、实验动物选择 选用健康、成年近交系LEW大鼠 （主要组织相容性复合体单倍体型Rt.1l）和近交系DA大鼠（主要组织相容性复合体单倍体型Rt.1a），雄性，体重270-320克。 北京大学医学部实验动物中心提供。 三、移植骨的制备 LEW和DA大鼠各12只做为供体。无菌条件下取其双侧股骨，除去骨髓及附着软组织， 修剪成3mm×4mm形状规则的半管状皮质骨块，0.9%氯化钠注射液反复冲洗。 将其中24块皮质骨（LEW、DA大鼠股骨各12块）装入双层无菌血浆袋中，热压封口，置入-20℃低温冰箱中冻存2周， 制成冷冻异体骨，植入前浸于30-37℃的0.9％氯化钠注射液中复温30分钟。 将另外24块皮质骨做为新鲜异体骨，在2小时内植入受体。 四、动物模型建立 LEW大鼠48只做为受体。0.6%戊巴比妥钠（5ml /kg）腹腔注射麻醉，腹卧位固定，左后肢前外侧切口，长约3cm，切开皮肤、皮下组织，沿肌间隙分离，暴露股骨中段，口腔科高速裂钻截骨， 造成股骨干中段3mm×4mm大小的骨缺损模型。 将移植骨正位植入后，逐层缝合伤口。 五、主要试剂 TGF-β1免疫组化试剂盒及TGF-β1原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程公司提供）。 六、观察方法 取材后组织标本以10%中性福尔马林固定48-72小时；10%EDTA脱钙2周，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5um连续切片，分别进行HE染色，TGF-β1免疫组化染色及原位杂交检测。光镜下观察各组移植骨修复情况。 将已判定为阳性的组织切片，随机抽样做空白对照，以PBS缓冲液代替一抗或杂交液。其他步骤不变。以空白对照实验的染色程度确定是否阳性, ≤空白实验染色强度为阴性,空白对照染色强度为阳性。阳性表达以组织和/或细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为判断标准。以乳腺癌标本作为阳性对照。 七、图像分析和统计学方法 1．骨组织形态计量分析 每张HE染色组织切片随机选取5视野，经计算机自动图像处理系统计算新生骨组织密度。 新生骨组织密度=新生骨组织面积/总骨面积。 2．TGF-β1原位杂交结果图像分析 将原位杂交组织切片随机选取 5个视野，经计算机