5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段(新)程序.ppt

（一）理论上DNA扩增数目的计算 四、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关 光吸收 波长／nm 260 240 220 280 0.1 0.2 2 、过程 ①稀释 2μL PCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释 ②对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值 ③测定并计算 DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数 50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1, DNA 的含量为50?g /mL 紫外分光光度计 比色杯 体内DNA复制与PCR的技术区别： 体内复制 PCR技术 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开 加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶 引物 一小段RNA 一般用DNA片段 DNA聚合酶 细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温） TaqDNA聚合酶 复制特点 半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。 半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。 复制的方向 子链的5’端向 3’端延伸 子链的5’端向 3’端延伸 课堂小结 多聚酶链式反应扩增DNA片段 PCR原理 DNA的复制需要酶、原料、能量、引物 DNA的变性和复性受温度影响 PCR过程 变性 复性 延伸 操作步骤 配制PCR反应体系 移入离心管 放入PCR仪 设置工作参数 DNA扩增 测定含量 稀释 调零 测定并读数 计算 练习巩固： 1.做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A.反复洗涤 B.不怕外源DNA污染 C.高压灭菌 D.在-20℃储存 2.PCR技术最突出的优点是 A.原理简单 B.原料易获得 C.Taq DNA聚合酶有耐热性 D.快速、高效、灵活、易于操作 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步：高温变性 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸 靶序列 靶序列 第1个PCR循环完成后 ：得到两个靶序列 * * 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就由可能为案件的侦破提供证据。 讨论： 1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？ 2.你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？ ★分子生物学研究中最强大的实验技术之一 ★其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程 美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis) 发明了PCR技术　 1993年诺贝尔奖 （一）DNA分子的结构 C、H、O、N、P 1.元素组成： 脱氧核苷酸 2.基本单位: 一、基础知识 脱氧核苷酸 脱氧核苷 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 A G C T DNA的基本单位－脱氧核苷酸 1 2 3 4 5 O 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 脱氧核苷酸的种类 A 腺嘌呤脱氧核苷酸 G C T 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’，5’-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 3.脱氧核苷酸链的形成 脱氧核苷酸链结构简图 A T G C A G C T 氢键 5端 3端 5端 3端 DNA分子的平面结构 DNA分子的平面结构 A T G C A G C T 氢键 5端 3端 5端 3端 识别 ： -OH端为3′; 磷酸基团的末端为5′。 4.DNA分子的双螺旋结构 ⑴.DNA分子是由 的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。 ⑵. 与