4.琼脂糖凝胶电泳检测dna-2013zj程序.ppt

loading buffer 里一般有两个指示剂。一个是溴酚蓝，一个二甲苯青，在琼脂糖浓度为1%-5%时，两者的电泳速度基本恒定。溴酚蓝的速度相当于300bp的条带，二甲苯青指示4000bp的条带。电泳时，看到一前一后的蓝带和青带既是这两个指示剂。 * EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。 * （配制浓度依照所提质粒的大小来确定）. 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。 * * * * * * * * 实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 【一】实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法； 检测质粒DNA提取的结果； 检测PCR扩增目的基因的结果。 检测酶切的结果。 【二】实验原理 （1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。 （2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA 分子大小来确定。 （3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。 【三】实验仪器、材料与试剂 （1）质粒DNA样品和PCR样品。 （2）凝胶电泳系统和凝胶成像系统等。 （3）琼脂糖、1XTBE电泳缓冲液、6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）、溴化乙锭、和DNA分子量标准等。 凝胶电泳系统 DYY-6C型 ?双稳定时电泳仪电源（北京六一） 输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)????? 4-400mA?(1mA)????? 240W  美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell ?凝胶成像分析系统 MC Marker DNA Marker: 一个已知分子质量的DNA样品做对照，用来确定待测样品的相对分子质量。 常用电泳缓冲液 缓冲液 缓冲容量 迁移速度 分辨率 用途 TAE 最低 最快 (高10％) 高分子量高 高度复杂DNA混合物；超螺旋DNA TBE 很高 较慢 低分子量高 价格昂贵，不常用 TPE 维持合适的pH 使溶液具有一定的导电性 EDTA螯合Mg2+ 等离子， 抑制DNA酶 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 上样缓冲液 溴化乙锭 溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐Ethidium　Bromide，EB），EB染色（EB可很好地掺入到双链DNA中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对DNA进行染色和观察。 用于观察的紫外光有３种波长，一般使用中波紫外光（３０２ｎｍ）。 短波紫外光（２５４ｎｍ）观察效果较好，但对DNA的破环很大。 长波紫外光（３６６ｎｍ）：回收。 【四】实验步骤 制备琼脂糖凝胶（1%） 制备凝胶板 加样 电泳 染色 结果观察 　 （1）制备凝胶和胶板： 40ml(1×TBE)+0.4g琼脂糖（ 三角瓶 ）， 煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。 （2 ）加样： 20μl PCR产物 10μl质粒DNA+2μl上样缓冲液，混匀 酶切产物DNA+上样缓冲液，混匀 6μl DNAMark （3 ）电泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向 （4 ）染色：EB染色约15min （5 ）图像采集：凝胶成像系统观察结果。 制 胶 点 样 电 泳 图像采集 【五】实验结果 * * DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 凝