5.3血红蛋白的提取和分离程序.ppt

7.下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是 ( )多 A.采集血样后要高速短时问离心获得血细胞 B.洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血 浆蛋白无法除净。 C.在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白 D.释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂 质分离开来 BCD 8.在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是 ( ) A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果 C洗涤过程选用0.1%的生理盐水 D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质下 D 蛋白质分离的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 一、基础知识 （一） 凝胶色谱法 2.凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。 1.概念： （分配色谱法） 3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程 4.凝胶色谱法的原理 ①相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢; ②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。 进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？ 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 （二）缓冲溶液 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响， 维持PH基本不变。 1.作用: 2.缓冲溶液的配制: 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 3.在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液, 成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？ （三） 电泳： 1.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联） 丙烯酰胺和交联剂 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 带电粒子在电场的作用下发生定向迁移，在加入SDS排除电荷多少的影响后，使电泳迁移率完全取决于分子大小，从而达到分离的目的。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳： 用SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 ①相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢; ②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 凝胶电泳的原理 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 带电粒子在电场的作用下发生定向迁移，在加入SDS排除电荷多少的影响后，使电泳迁移率完全取决于分子大小，从而达到分离的目的。 蛋白质提取和分离步骤 具体操作 步骤 （一） （二） （三） （四） 二、实验操作 哺乳 血液 血 浆 水 分 固体物质 血浆蛋白 无机盐 磷 脂 葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （ ） 90％ 有没有，多不多，易不易 1.洗涤红细胞 1.1 洗涤的目的：洗去血液中血浆及血小板等中的杂蛋白 1.2 洗涤过程： 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有 防止破坏红细胞，使血红蛋白流失 （一）样品处理 黄色 2. 血红蛋白的释放 原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放血红蛋白 3.分离血红蛋白溶液 分离过程： 红细胞 混合液 离心管 甲苯层 脂类物质 血红蛋白层 破碎物沉淀层 高速离心 10min 滤纸 过滤 脂类物质