4 沉淀法_生物分离工程研讨.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第二步沉淀提取 溶于尿素盐酸溶液中 （粗碱干重: 尿素: 水: 浓HCl 1:2:2:0.25） 粗碱 粗碱尿素溶液 沉淀 四环素尿素复盐 丁醇清液 丁醇悬浮溶液 　 溶于酸性丁醇中　　　　　　　　　　　　　　　复盐干重:丁醇:浓HCl＝1:10:0.3　　 (丁醇先，搅拌下滴加HCl) 滤去不溶物 浓氨水调pH4.6～4.8 搅拌20min，过滤 结晶 7、讨论题：咸蛋煮熟了，蛋黄里会有油，这是什么缘故？ 熟鸭蛋蛋黄中脂肪的含量高达31％，为什么看不到一点油？可是在熟咸蛋的蛋黄中，却经常可以看到黄色的油滴往外流？ 讨论题：咸蛋煮熟了，蛋黄里会有油，这是什么缘故？ 蛋黄中除了脂肪以外，还含有丰富的蛋白质，蛋白质就是一种高明的乳化剂，它能够把蛋黄中的脂肪分散成很小的油滴，这样就骗过了我们的眼睛和舌头。 在盐渍过程中，作为乳化剂的蛋白质被盐析出来，乳浊液被破坏了，那些原来分散成极小的油滴，彼此就互相聚集起来，变成大油液，使得整个蛋黄变成油滋滋的，甚至流出油来了。 思考题： 什么是沉淀法，具体包括哪些方法？ 理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析 盐析的机理是什么？ 影响盐析的因素有哪些？ 有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？用乙醇 沉淀蛋白质时应注意哪些事项？ 何为选择性变性沉淀法？ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * １）金属离子沉淀 金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到1905年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得到的。 常用金属离子： Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。 Ca2+（CaCO3）用于分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。 硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属， MgSO4用以去除DNA和其他核酸； 成盐类复合物沉淀 金属离子沉淀蛋白质 一般可分三类： ①能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、 Fe2+ 、 Ｃo2+、 Ni2+ 、 Ｃu2+、 Zn2+ 、 Cd2+ ; ②能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：Ca2+ 、 Ba2+、 Mg2+ 、 Pb2+ ; ③能与巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：Ｈg2+ 、 Ag2+ 、 Pb2+ 。 金属离子的浓度常为0.02mol/L。 例： 调pH4.0　　　　　沉淀（杂蛋白） 胰岛素粗品溶液 30 % 丙酮　　　　上清液 　　　　　调pH6.0 上清液 　　　　　Zn2+ 胰岛素锌盐↓ 金属离子沉淀蛋白质 2．有机盐法含氮有机物如苦味酸、苦酮酸、鞣酸、尿素等能与有机分子碱性基团形成复合物而沉淀。 3．无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。 以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。 若沉淀为金属复合盐，复合物中金属离子的去除可用离子交换法、EDTA螯合剂、通H2S使金属变成硫化物而除去； 若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法除去。 成盐类复合物沉淀 16.８ 亲和沉淀affinity precipitation 亲和沉淀是沉淀分离的一种，将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量有机结合形成了亲和沉淀技术。 其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同：不是依据蛋白质溶解度差异，而是依据“吸附” 蛋白质的特殊聚合物溶解度的大小。 利用蛋白质与特定的配基（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。 亲 和 沉 淀 亲和沉淀过程： 配基与载体的选择 将配基与可逆溶解载体偶联后形成载体-配基复合物， 将目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配基络合形成复合体； 改变溶液条件，使复合体沉淀析出； 所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质； 用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。 例子：胰蛋白酶的亲和沉淀 配基（大豆胰蛋白酶抑制剂）固定于载体（聚合脂质体-醇磷脂乙醇胺 胰蛋白酶粗溶液加入一定量聚合物溶液进行吸附； 加入0.2MNaCl使复合体沉淀 0.01 M NaOH洗脱沉淀，释放胰蛋白酶 16.