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第四章 酶分子修饰与应用 1 酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。 2 酶分子修饰的意义？ （1）提高酶的活力； （2）增强酶的稳定性； （3）降低或消除酶的抗原性； （4）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系。 第一节 酶分子的主链修饰 1 酶分子的主链修饰：利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 2 酶分子主链修饰的意义？ （1）可提高酶的活力； （2）可降低或消除酶的抗原性； （3）可预测酶活性中心在主链上的位置，从而了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献。 （一）主链的切断修饰 ① 主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。 ② 主链断裂后，酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。这样可以提高药用酶的使用价值。 ③ 主链断裂有利于酶活性中心的形成，则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。 （二）主链的连接修饰 将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体。 酶的侧链基团修饰 采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。 酶的侧链基团的意义： （1）可以研究各种基团在酶分子中的作用，并可以用于研究酶的活性中心中的必需基团。如果某基团修饰后不引起酶活力的显著变化，则可以认为此基团属于非必需基团；如果某基团修饰后使酶活力显著降低或丧失，则此基团很可能是酶催化的必需基团。 （2）可以测定某一种基团在酶分子中的数量。采用三硝基苯磺酸测定氨基的数量；对氯汞苯甲酸测定巯基的数量；碳二亚胺测定羧基的数量；四唑重氮盐测定咪唑基的数量等。 （3）可以提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性，以提高酶的使用价值。 （4）可能获得自然界原来不存在的新酶种。例如，某些抗体酶和人工改造的核酸类酶等。 （一）氨基修饰 氨基修饰：采用氨基修饰剂（能使酶分子侧链上的氨基发生改变的化合物）使酶分子侧链上的氨基发生改变，改变酶蛋白的空间构象，从而使酶的稳定性大大提高的方法。常用的氨基修饰剂有亚硝酸、2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBS）、2, 4-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）等。 二、羧基修饰 羧基修饰：通过修饰剂（可与蛋白质侧链上的羧基发生反应的化合物）与酶蛋白侧链的羧基发生酯化、酰基化等反应，使蛋白质的构象发生改变，用于定量测定酶分子中羧基数目的方法。常用的修饰剂有碳二亚胺、重氮基乙酸盐、异嗯唑盐等。 三、巯基修饰 巯基修饰：采用修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基（半胱氨酸）结合，使巯基发生改变，从而显著提高酶的稳定性的方法。 常用的修饰剂有：二硫苏糖醇、巯基乙醇等。 四、胍基修饰 胍基修饰：采用修饰剂（二羰基化合物）与酶蛋白侧链上的胍基（精氨酸）反应生成稳定的杂环，从而改变酶分子构象的方法。常用的修饰剂有丁二酮、丙二醛、苯乙二醛等。 五、酚基修饰 酚基修饰：通过修饰剂的作用使酶分子上的酚基（酪氨酸）发生改变，从而提高酶的催化活性，增强酶的稳定性的方法。 六、咪唑基修饰 咪唑基修饰：通过修饰剂的作用使酶分子中的咪唑基（组氨酸）发生改变，从而改变酶分子的构象和特性的方法。常用的修饰剂有：碘乙酸，焦碳酸二乙酯。 七、吲哚基修饰 吲哚基修饰：通过改变酶分子上的吲哚基（色氨酸）而使酶分子的构象和特性发生改变的方法。 八、分子内交联修饰 分子内交联修饰：利用双功能试剂使酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶分子稳定性的方法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺等。 九、大分子结合修饰 大分子结合修饰：修饰剂（水溶性大分子）与酶蛋白的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而提高酶活力，增加酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性的方法。是目前应用最广泛的酶分子修饰方法。常用的修饰剂有聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、环状糊精、羧甲基纤维素等。PEG具有溶解度高，既能溶于水，又能够溶于大多数有机溶剂，通常没有抗原性，没有毒性，生物相容性好等特征，成为目前应用最为广泛的大分子修饰剂。 十、亲和修饰 亲和修饰（位点专一性修饰）：是指修饰剂（亲和标记试剂）只专一地与酶分子某一个位点上的某一个基团发生反应，而与此位点以外的同一种或不同种基团都不发生