第八章细胞工程制药技术技巧.ppt

细胞工程的主要内容 动植物组织、细胞培养技术 细胞融合（细胞杂交） 细胞拆合与核移植 细胞器移植 染色体工程 胚胎工程 细胞与基因治疗 第二节　动物细胞工程制药 一、生产用动物细胞的来源 原代细胞：直接来自动物体，如鸡胚细胞。 二倍体细胞系：如WI-38，美国从人的正常胚肺中分离的成纤维细胞。 可无限传代的转化细胞系：采用病毒如SV40或某些化学试剂如甲基胆蒽处理二倍体细胞；直接从动物的肿瘤组织中分离。如Namalwa, CHO, BHK-21等。 经融合和重组的工程细胞系：融合细胞、工程细胞等。 许多国家有专门细胞保存机构 二、细胞培养 培养条件 器材洗清灭菌、水质、酸碱性、渗透压、温度、空气 培养基 天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水等。 合成培养基：BME、MEM、DMEM、HAMF12和RPMI1640等。包含氨基酸、维生素、激素、脂肪酸、无机盐及其它成份 培养方法 悬浮培养、贴壁培养、悬浮-贴壁培养等 细胞培养过程 小型细胞培养反应器 三、动物细胞药物 细胞因子类药物：一组不同种类的调节糖蛋白。担任细胞间的化学传感器，通过与细胞表面特定受体结合来产生作用，从而触发细胞内信号传导活动。 激素类药物：由机体的特殊腺体合成和释放，通过循环系统，作用于靶细胞的微量化学信息分子。 酶类药物：来源动物细胞的治疗用酶 细胞因子的主要类型 细胞因子产生途径 干扰素 兽用与医用性腺激素 胰岛素 第四节　植物细胞工程制药 植物细胞的全能性：发育全能性、物质代谢全能性 细胞与组织及其培养　固体培养、液体培养 利用组织培养技术快速繁殖药用植物　试管苗 利用离体细胞大量生产次生代谢物质　反应器发酵技术 组织培养流程 培养基 无机营养成分 就是人们平常所说的矿物质、无机盐或无机元素。它包括大量元素（N、P、K、Mg、S、Ca）及微量元素（Fe、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo等。 有机营养成分 它包括维生素、氨基酸、碳水化合物通常为蔗糖或葡萄糖。 植物生长调节剂 生长素、细胞分裂素、赤霉素和乙烯等。 琼脂或其他支持物 除液体悬浮培养外，所有的培养物都应生长在固定或半固定的培养基上以防止培养物沉入液体培养基，因缺氧而死亡。就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。 其它添加剂 包括一些天然提取物、活性炭、抗生素等。 三、植物离体细胞培养 细胞系，外植体：生产用细胞 培养基：碳源、氮源、维生素等 培养器：反应器、三角瓶 培养方式：固体培养、液体培养 培养程序：二步法（生长、生产） 产物分离 植物细胞培养器 Thank you 接种 接种 切取 骨髓瘤细胞 (myeloma cells): 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。 经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株—没有抗体分泌物。 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 长命 不分泌抗体 分泌抗体 短命 分泌抗体 长命 K?hler和Milstein, 1975 1984年Nobel医学奖 细胞融合 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 脾细胞/?脾细胞 骨髓瘤细胞/ ?骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞 脾细胞 筛选出 不能长期存活 不能长期存活 杂交瘤细胞的筛选 HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶 DNA 内源性途径(主要途径) 次黄嘌呤核苷酸 尿嘧啶核苷酸 二氢叶酸还原酶 A H T 外源性途径(旁路途径) (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT ) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) 外源性途径(旁路途径) HAT培养基筛选 HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡； 骨髓瘤细胞：DNA合成的主要途径被A阻断，HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻。不能生长，5~7天死亡； 杂交瘤细胞： 长期生长繁殖，利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力 筛选 AA型、BB型 AB型杂交瘤细胞 能产生所需抗体的细胞 （二）杂交瘤的制备 1.免疫动物 免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远，产生的杂交瘤越不稳定，所以一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。常用的骨髓瘤品系来自 BALB/c小鼠和Lou大鼠。