microRNA的实时定量茎环RTPCR技术.docVIP

microRNA的实时定量茎环RT-PCR技术 摘要： 已开发一种新型的microRNA（miRNA）的方法利用茎环Taqman PCR分析。茎环RT引物在RT 和特异性方面比传统的更好。TaqMan miRNA的检测成熟miRNAmiRNAs。此外，他们不会受到基因组DNA污染。精确量化低至25皮克的总RNA大多数miRNA。事实上，这种方法灵敏度高，特异性和精密允许无核酸纯化，直接分析单细胞。如标准TaqMan基因表达分析TaqMan miRNA的检测显示出了7个数量级的动态范围。七个小鼠组织miRNA定量显示10到超过30000个。这种方法可以快速，准确，灵敏miRNA表达谱，并能识别和监控特定组织或疾病的潜在生物标志物。茎环RT-PCR可用于其他小RNA分子，如短干扰RNA（siRNAs）的量化。此外，为更好的特异性和效率茎环RT引物设计的概念可以应用在小分子RNA克隆和多重检测miRNA是自然发生的，高度保守家庭，。miRNA在动物和植物的基因组发现。到为止，有1000个独特的，在桑格中心miRNA的注册表中包括326人类miRNA。 miRNA是通过催化mRNA的分裂或抑制调节基因表达。他们被认为细胞发育，分化和。具体职责包括调节细胞增殖和，发育时间，细胞死亡，造血，神经发育，人类肿瘤与DNA甲基化和染色质修饰。 虽然miRNA的相对丰富，其表达水平物种之间相差。低丰度的miRNA经常逃避检测技术，如克隆，Northern杂交和基因芯片分析这里，我们提出一种新型实时定量准确miRNA与其他小分子RNA。这种方法扩展实时PCR技术，从大分子的基因表达微分子的变化检测。 桑格中心的miRNA注册 http://www.sanger.ac.uk/Software/ Rfam/mirna/index.shtml中筛选目标，引物和探针TaqMan miRNA检测，可通过应用生物系统公司（P / N4365409）。miRNA标准TaqMan分析，采用PrimerExpress软件PRI-LET-7A-3和PRI-MIR-26B和miRNA前体miR-30A。所有序列补充资料部分。合成miRNA寡核苷酸Integrated DNA Technolo-gies (IDT, Coralville, IA)购买。 RNA样本组织，细胞，细胞裂解物和总RNA制备 从Ambion公司（P / N7810，7812，7814，7816，7818，7824，7826和7968）购10-12天脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和总RNA样品。 Ambion公司RNA来自瑞士韦伯斯特小鼠。基于TaqMan基因表达分析人类或小鼠的3 - 磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）内对照（P / N4310884E4352339E，应用生物系统公司）所有的RNA样品进行标准化。 两个细胞株HepG2和OP9，培养，使用Gibco公司MEM（P / N 12492-021，Invitrogen，Carlsbad, CA）补充10％胎牛血清（FBS）(P/N: SH30070.01, HyClone, Logan, UT)用血球胰酶消化细胞计数。约2.8×106个悬浮细胞通过离心沉淀，1500r.p.m.5分钟，1毫升 MgCl2 and CaCl2的杜尔贝科的磷酸盐缓冲液（PBS） 细胞悬浮于140毫升PBS，并用三种不同的样品制备方法处理。第一种方法，一个50毫升的样本（106个细胞）等量的核酸纯化裂解液混合用吸管，然后。裂解液1 U / ml的RNase抑制剂溶液稀释1/10。在第二种方法中，用mirVanamiRNA提取试剂盒50毫升的样本（106个细胞）。纯化总RNA100毫升洗脱缓冲液洗脱。第三种方法1×PBS稀释1/2，95℃加热5分钟，立即mirVana miRNA检测试剂盒检测miRNA 根据制造商的协议使用mirVanamiRNA的检测试剂盒miRNA杂交由IDT合成RNA探针。放射性同位素标记的RNA片段气旋存储荧光粉系统进行检测和定量。 逆转录反应中包含的RNA样品，包括纯化总RNA，细胞裂解物，热处理细胞，50纳米的茎环RT引物，1RT缓冲液，每dNTPs浓度0.25毫米，3.33 U / μL 的逆转录和0.25 U / μL的RNase抑制剂。7.5升在970096- 或 384-平板上16℃培养30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，然后4℃。所有逆转录反应，包括无模板对照和RT，。 PCR 标准的TaqMan实时PCR。 10μLPCR0.67μLRT产物，1×TaqMan Mix ，0.2μM的TaqMan探针，1.5m M正向引物和0.7μM反向引物。反应在 384-95℃培养10分钟，95℃