第三章动植物细胞培养产酶技巧.pptVIP

Chapter 3  The production of Enzyme byCulturing of Animal or Plant Cells 动 植 物 细 胞 培 养 产 酶 动 植 物 细 胞 培 养 产 酶 概述 动物细胞 无细胞壁，容易贴壁 对营养要求严格（血清培养基） 对环境敏感（pH、溶氧、温度、剪切应力） 植物细胞 有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱 营养要求较动物细胞简单 生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难 动 植 物 细 胞 培 养 产 酶 概述 植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较 动 植 物 细 胞 培 养 产 酶 本章主要内容 1、动植物细胞中酶生物合成的调节 2、植物细胞培养产酶 植物细胞及其培养特点 植物细胞培养及产酶的工艺控制 3、动物细胞培养产酶 动物细胞及其培养特点 动物细胞培养及产酶的工艺控制 3.1 动植物细胞中酶生物合成的调节 从基因到蛋白质 动植物细胞具有比微生物更多的调节方式 转录水平调节 翻译水平调节 激素、神经调节 真核生物基因表达调控 3.1 动植物细胞中酶生物合成的调节 端粒是真核生物染色体的末端结构 由富含 G、T 的 DNA 简单重复序列不断重复而成 人端粒序列：……TTAGGG…… 功能：保护真核生物染色体免遭破坏 牺牲自我，填补 DNA 复制后在5’-端留下的空隙 端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短 端粒酶（telomerase）—— 催化端粒合成和延长 核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重复序列 端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中 通过增加基因的拷贝数（染色体上的重复次数）调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过程。 细胞的一种应急方式。 基因扩增可以由选择压力引起： 耐药性细胞的抗药性产生 例：CHO 细胞【中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary ) 】为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增。 增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些酶基因的表达。 具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同。 A QUESTION: 抗体酶是酶还是抗体？ 3、抗体酶制备方法： 抗体酶（abzyme）：催化性抗体，是具有生物催化功能的抗体分子，是人工改造的对抗体可变区赋予催化特性的特殊抗体 诱导法（主要方法） 半抗原诱导 酶蛋白诱导 修饰法 在抗体与抗原结合部位引进催化基团 3.2 植物细胞培养产酶 1902年，Haberlandt首次提出分离植物单细胞并培养成植株的设想 植物细胞的全能性 植物细胞培养产酶种类 3.2 植物细胞培养产酶 1. 植物细胞及其培养特点 2.植物细胞培养及产酶的工艺控制 植物细胞结构 植物细胞的主要特点 体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大 细胞生长缓慢、周期长：细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞 营养要求简单：相比动物细胞 需要光照：细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件 对剪切力较敏感 主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物） 植物细胞培养的优势 优点（相比提取分离法） √提高目标物的产率 √缩短生产周期 木瓜蛋白酶：木瓜生长期8个月，木瓜细胞培养约1个月 √易于管理，不受自然因素控制 √可以提高产物质量 通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染 缺点 √培养条件要求高 —— 光照、剪切力影响显著 √植物细胞生长缓慢 —— 相对于微生物 植物体外培养 胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养 植物细胞培养 —— 外植体选择和处理 外植体（explant） 从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小块 根、茎、叶、芽、花、果实、种子等 选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则 切片：0.5～1 cm 消毒 70% 乙醇 5% 次氯酸钠 / 10% 漂白粉 0.01～0.1% HgCl2 直接分离法 直接分离法即直接从外植体中分离 机械法 将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞 质壁未分离；细胞破碎率高，完整细胞数量少 酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞 能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护（比如加入甘露醇） 愈伤组织诱导法 愈伤组织（callus） 由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散排列的薄壁细胞群体；本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的组织。 诱导过程 配制半固体诱导培养基 灭菌、植入外植体 1～3周后继代培养 原生质体再生法 一般采用酶解法分离原生质体，使用纤维素酶和果胶酶混合物。 保持溶液的高渗状态 防止原生质体胀裂 渗透压稳