第六章诱变育种详细分析.pptVIP

第一节 诱变育种的设计和准备 第二节 诱变育种的步骤与方法 第三节 突变株的分离与筛选 第四节 营养缺陷型菌株的诱变和筛选 第一节 诱变育种的设计和准备 第二节 诱变育种的步骤和方法 第三节 突变株的分离与筛选 第四节 营养缺陷型菌株的诱变和筛选 氨基酸合成代谢的人工控制赖氨酸高产菌 思考题 1、何谓诱变育种？诱变育种的主要步骤是什么？ 2、诱变剂对产量性状的诱变作用有何特点？ 3、请设计一个获得营养缺陷型菌株的诱变育种实验方案。 活性测定是菌种筛选工作的重要组成部分，也是决定筛选效率的主要因素。 通常，每种代谢产物都有各自的经典方法，这些方法本身是精确的，在样品少的情况下，具有相当的可信度。但经典法往往操作繁琐，从样品处理到测定完毕要花费较长时间，结果使产物失活而带来误差，失去可比性。因此，在筛选工作中寻找并建立一个简便、快速、又较准确的检验方法显得十分重要。 五、产物活性测定 几个常用于摇瓶初筛阶段测定产物的简便、易行的方法 1．琼脂平板活性圈法（圆孔法） 该法是在特制的玻璃框琼脂平板上进行的，以检验菌或底物与一定量的琼脂制成平板，用专制的打孔器取出琼脂块，在留下的圆孔中加入发酵液，在适合温度下培养一定时间，测量圆孔周围形成的抑菌圈或水解圈，根据活性圈的大小挑选高产菌株。 2．纸片法 随着诱变代数的增加，有效产物浓度不断提高，当发酵液中产物浓度相当高时，活性圈大小与产物浓度之间失去线性关系，掩盖了菌株的高产性能而被漏筛。此时可改用纸片法。 具体做法是：取直径0.5 cm圆纸片，灭菌后覆于含底物或检菌的琼脂平板上，准确取发酵液1-2 μl 在滤纸片上，置于一定温度下培养20-25h，测量水解圈大小。如果活性圈仍然很大(Φ15mm以上)，则可将发酵液稀释，或者增加底物的浓度和琼脂板的厚度，使水解圈控制在一定范围内。 3．琼脂薄层纸片法 此法更适合抗真菌抗生素和农业抗生素野生菌的初筛和诱变菌株的初筛。 具体做法为：将制备的病原菌孢子悬液，加入45-50℃的培养基中，混匀倾倒于26cm x16cm 无菌玻璃板上，均匀摊平，制成厚度约1mm的薄层琼脂板。将圆滤纸片依次覆于板上，每块玻璃板可排5行，每行15-18个，编号，用移液器分别加1-2 ul发酵液。在玻璃板两端底部各放上一块条状的玻璃，作垫子，上盖一块灭菌过的玻璃板。然后，把它们放入底部置有浸湿纱布的搪瓷盘，以便保湿。加盖，于适宜的温度下培养大约3-4d。置于解剖镜或立体显微镜下观察孢子萌发，菌丝形态，并测量抑菌圈大小。 为了提高育种效率，在大的布局上，应采用快速循环筛选法，即几条循环线同时进行筛选。 如：若完成一次循环需要40d，那么每隔10d进行一条筛选线，使4条循环线交错进行，每条循环线使用不同的出发菌株、诱变剂及不同的培养条件。 六、数据的统计分析 七、培养基和培养条件的调整 八、变种的特性研究与鉴定 从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株，称为野生型菌株(wild type strain)。 野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养(氨基酸、维生素、核酸等)的能力，只有在基本培养基上补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型菌株(auxotroph strain)。 营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同，称为原养型(prototroph)。 营养缺陷型菌株 在筛选营养缺陷型菌株过程中，有关的培养基有三类。 ①基本培养基(minimal medium，MM)：仅能满足野生型菌株生长需要的培养基，称为基础培养基，有时用“[-]”表示。不同微生物的基本培养基是不相同的。 ②完全培养基(complete medium，CM)：可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基，称为完全培养基，有时用“[+]”表示。完全培养基营养丰富、全面，一般可在基本培养基中加入富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质配制而成。 ③补充培养基(supplemental medium，SM)：只能满足相应的营养缺陷型生长需要的合成培养基，称为补充培养基。它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成的。根据所加营养因子的种类不同而用[A]或[B]等来表示。 营养缺陷型菌株的筛选一般包括诱发突变、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴别缺陷种类等步骤。 (一)营养缺陷型的诱变 用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍，紫外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高，一般可达10％。 影响缺陷型突变率的因子很多，除诱变剂种类之外，与诱变剂量也有很大关系，一般随处理剂量的提高突变频率也增加。 一、营养缺陷型菌株的