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羧甲基壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架材料的制备及生物安全性 摘要： 为了探讨羧甲基壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CMCTS/n-HA)复合支架材料的制备及其生物安全性,采用化学沉淀法合成了纳米羟基磷灰石粉体(n-HA);以无水乙醇为沥滤剂,以16.7%(质量分数)的柠檬酸水溶液作粘接剂,通过粒子沥滤法制备CMCTS/n-HA多孔复合材料。对其孔隙率及抗压强度进行测试,并将其植入大白兔骨缺损处观察组织学变化并进行肝肾功能检测。CMCTS/n-HA复合多孔材料的孔隙率接近75%,孔隙尺寸分布约从几微米到600μm ,并且孔隙之间相互贯通,其抗压强度可达21MPa以上,植入大白兔骨缺损处未见引起骨组织明显的炎症反应及骨坏死,肝肾功能检测未发现有肝肾毒性。CMCTS/n-HA可以满足骨组织工程支架的基本要求。 引言 骨缺损是骨科临床常见的难症之一。组织工程化骨的应用为骨缺损的治疗带来良好的前景, 目前多数学者认为组织工程化骨制备的重点是组织工程支架材料的研制构建。羟基磷灰石(Hydrox yapatite, HA)是人体骨组织的主要成分,具有良好生物相容性、生物活性及骨传导性, 已广泛用于修复各类骨缺损, 但由于易发生脆性断裂、疲劳破坏及不可降解性,长期疗效不尽人意。虽然HA 纳米化后生物力学及可降解性得到改善, 但仍距骨组织工程支架材料的要求相差甚远, 还存在一定不可克服的缺点。为了提高材料的力学性能及新骨的形成速度, 采用不同性质的材料进行杂化以获得具有新性的杂化支架材料, 成为当前生物材料研究的热点 。壳聚糖(Chitosan ,CS)能增加碳酸化羟基磷灰石骨水泥固化液的黏度系数[Takagi 等用CS 和磷酸钙制备了有良好赋形性质和生物亲和性的硬组织修复材料, 具有与人体骨组织更为接近的理化性能。CS 的主要成分是氨基葡聚糖, 具有诱导刺激组织再生重建的活性, 能够诱导骨与软骨细胞再生。 1 　材料与方法1 .1　材　料 n-HA 粉体由本实验室采用化学沉淀法制备(其微观形貌见图1);N , O-羧甲基壳聚糖,购自青岛海汇生物工程有限公司,羧甲基取代度为90.5 %, 脱乙酰度88 .6 %;对二氯苯,无水乙醇,柠檬酸, 均为分析纯。 1 .2 　CMCTS/n-HA 复合支架材料的制备 将n-HA 与CMCTS分别按质量比为9：1、8：2、7：3、6：4和5：5配料,机械球磨使其充分混合,再按CMCTS/n-HA复合粉体与造孔剂对二氯苯1∶1的质量比例称料,充分研磨混合,然后超声振荡2h ,使它们充分混匀。加入质量分数为16.7%柠檬酸溶液,调和均匀,放入柱状模具中, 加压成型,保压60s ,脱模,置于冷冻干燥机中冷冻干燥。 1 .3 　CMCTS/n-HA 复合支架材料性能测试 采用扫描电子显微镜(SEM)对样品的组成、结晶强弱及形貌特征进行表征,并用新三思CMT700型万能材料试验机和排水法分别测定多孔材料的抗压强度和孔隙率。 1 .4 　CMCTS/n-HA 生物安全性测试 清洁级雄性日本大耳白兔32 只,体重2.4 ～2.8 kg。随机抽取16 只作为实验组,每只兔子采用氯胺酮0 .5 mg/kg及兽用速眠新Ⅱ注射液0.5 mg/kg复合麻醉后,显露右侧股骨干中段,以3 mm 钻头钻孔,将直径3mm的圆柱状的CMCTS/n-HA 植入其中后关闭伤口。其余16 只大白兔作为对照组,仅单纯显露右侧股骨中段并钻孔后,不作任何处理, 直接闭合刀口。于第3 周实验组与对照组分别随机处死大白兔各8 只,于第6 周剩余实验组与对照组动物全部处死。实验动物空气栓塞法处死前, 抽取静脉血3 mL ,检测血清谷丙转氨酶(Alanine transaminase,A LT ),谷草转氨酶(Aspartatetransaminase, AST)、肌酐(C reatinine , Cr)、尿素氮(Ureanit rogen , Urea)的水平。实验用动物处死后, 实验组取移植CMC TS/n-HA复合材料周围骨组织标本, 对照组取钻孔处骨组织标本, 4 %多聚甲醛固定, 采用乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙, 常规酒精脱水, 二甲苯透明, 浸蜡后石蜡包埋,行6μm 连续切片,做苏木素-伊红(HE)染色进行光学显微镜观察。 1 .5 　统计学研究 采用SPSS11.0 统计软件,肝肾功能分析数据以 x±s表示,采用单因素方差分析,检验水平:P 0 .05 。 2 　结果与讨论 2 .1 CMCTS/n-HA 复合支架材料表征及性能 本实验采用粒子沥滤法将n-HA与CMCTS结合杂化制备了高孔隙率CMCTS/n-HA 多孔复合材料。复合材料的成分