基因工程常规技术-凝胶电泳.pptVIP

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 用于双链DNA片段的分离纯化、蛋白质电泳 迁移率受碱基组成和序列影响、与蛋白质的结构及荷质比有关 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 用于单链DNA片段的分离或纯化、蛋白质电泳 迁移率与碱基组成及序列完全无关、与蛋白质的结构及荷质比无关 * 垂直板电泳装置 * * SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 十二烷基磺酸钠(SDS)和少量巯基乙醇 蛋白质中的多肽链处于伸展状态 形成SDS-蛋白质复合体 具有相同的荷质比 具有相同的构象 蛋白质 电泳速度由质量决定 原理 * 原态蛋白质 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区） * 凝胶染色方案 Ethidium bromide （EB） 核酸染色方案 1. EB染色 溴化乙锭:中等毒性物质 毒性：强诱变剂、致突变性 光敏感性：紫外、可见光 热敏感性：热挥发 * EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在紫外光照射下能发出红色荧光，EB-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，因此可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量成正比。 * 在EB存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%。当需要知道核酸片段准确大小时，应在无EB情况下电泳，结束后EB染色。 * EB替代物 Goldview：宣称无毒、不灵敏、影响回收、荧光易淬灭（吖啶橙？） GelRed/GelGreen：低毒，高效，价格昂贵 花青素类染料，如gene finder、SYBR Green：不稳定，易降解 * 银染色液中的银离子（Ag+）与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，把核酸电泳的条带染成黑褐色 银染法主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也可以用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍，但银染后，DNA不宜回收 2. 银染 * * 蛋白质染色方案 1.考马斯亮蓝染色法 常用的考马斯亮蓝有G250和R250两种。 凝胶染色使用考马斯亮蓝R250。染料可以和蛋白结合，使蛋白染色，与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，因此用来对电泳条带染色。 考马斯亮蓝染色可以达到0.2~0.5 μg（200~500 ng），最低可检出0.1 μg蛋白 考马斯亮蓝G250主要用于蛋白质含量测定 * * 2.银染色法 银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有 100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点。 * * 双向电泳（two dimension electrophoresis，2D）是分离混合蛋白质最常用的方法。 双向电泳由两部分构成：等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。 该方法是依赖于蛋白质的等电点的不同和相对分子质量的不同而构建的。 双向电泳技术 * 所用仪器 * 等电聚焦电泳 pHpI 带负电 pHpI 带正电 pH=pI 不带电 溶液 蛋白质 * 双向电泳 * * 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动 电泳 电泳（Electrophoresis） 正极 负极 带负电粒子 带正电粒子 * 电泳迁移率及其影响因素 迁移率：带电颗粒在单位电场下泳动的速度 迁移率的影响因素: 内在因素 外在因素 * 影响迁移率的内在因素 所带静电荷的多少——迁移率与表面电荷成正比。 大小和形状——直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快。 DNA构象——一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环 * Relaxed supercoiled Increasing degree of supercoiling 相同分子量的DNA: 闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。 * 影响迁移率的外界因素 电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 温度的影响 支持物的影响 * 电场强度 单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。 电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。 * 溶液的pH值 决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。 溶液的离子强度 电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低 原因：带电离子吸引相反电荷的离子聚集在其周围，相成一个与运动粒子电荷相反的离子氛（ionic atmosphere），它使该离子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。 * 温度的影响 电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响。 温度每升高1℃，