02菌种选育2014详解.ppt

生物工艺学(发酵工程) 用于工业生产菌种的要求和特点 1、能够利用简单的原料、廉价的培养基，大量高效地合成产物； 2、有关合成产物的途径要尽可能的简单，方便菌种改造； 3、遗传性能相对稳定； 4、不易感染他种微生物或噬菌体； 5、必须考虑产生菌及其产物的毒性（在分类学上最好与致病菌无关）； 6、菌种特性要与工艺控制的配套相适应。 几种常用保藏方法比较 思考题： 1、含微生物材料标本的处理方法有哪些？ 2、试根据待分离目的微生物的特点选择合适的分离方法与步骤。 3、种子扩大培养的目的 4、为什么种子要逐级扩大培养？什么情况下可采用一级种子？ 4、影响种子质量的因素有哪些？ 5、保证种子质量有哪些措施？ （5）控制培养条件 众多环境因素中，培养基组成、培养温度、菌体的比生长速率尤为重要。 对一个已经组建完成的克隆菌来说，选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。 （6）构建质粒时，插入一段能改良宿主细胞生长速率的特殊DNA片段。 （7）所用质粒不带有可转移因子。 （8）尽可能将质粒上的不需要的DNA部分除去。 （9）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。 第三节 菌种保藏 一、 菌种保藏的意义 二、 菌种保藏原理和方法 三、 国内外主要菌种保藏机构 菌种是国家的重要资源。 菌种保藏是微生物学研究和育种工作的重要组成部分。 任务: 不死亡、不污染、不退化。 1980年，中国微生物菌种保藏委员会成立。 一、 菌种保藏的意义 原理： 人工创造条件使微生物的代谢尽量降低，以减少变异。一般可通过限制营养、缺氧、干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态。 二、菌种保藏原理和方法 简便有效 1-2年 不产孢子或芽孢的微生物 干燥、低温、无营养、有油 菌丝速冻法 简便有效 5-15年以上 各类 干燥、无氧、低温、有保护剂 真空冷冻干燥保藏 简便有效 1-10年 产孢子微生物 干燥、无营养 沙土管保藏 简便 1-2年 各类 低温、缺氧 液体石蜡密密封存保藏 简便 3-6个月 各类 低温 斜面冰箱保藏 评价 保藏期 适宜菌种 主要措施 方法名称 （一） 斜面冰箱保藏法 4℃冰箱保存。保存期3月到6月。 （二） 沙土管保藏法 适合于产孢子或芽孢的微生物。 1、将沙与土洗净、烘干、过筛，1~2:1混匀，分装于小试管中，料高1厘米，121度间歇灭菌三次，烘干备用。沙80目，土80~100目。 2、将孢子制成悬液，接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。 3、保存期1年左右。 （三） 菌丝速冻法 不产孢子或芽孢的微生物可用甘油菌丝速冻法。 保藏温度为-20℃，为避免损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25％。 操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。 （四） 石蜡油封存法 向菌种斜面上，倒入一层灭菌石蜡油，量高出斜面1cm，保存冰箱中。 适于不能利用石蜡油作碳源的微生物。 保存期约1年。 （五） 真空冷冻干燥保藏法 基本原理：在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。 菌种可保存5年左右。 基本操作：将微生物制成悬浮液，与保护剂混合，放在安瓿管内，用低温酒精或干冰迅速冻结，低温下用真空泵抽干，真空熔封。低温保藏。 保护剂：脱脂牛奶或血清等。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。 保护剂的作用：在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。 （六） 液氮超低温保藏法 是近几年才发展起来的，国外已较普遍采用，适用范围最广。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。 （1）原理 液氮的温度可达-196℃，远远低于新陈代谢作用停止的温度(-130℃)，菌种代谢活动停止，化学作用消失。 （2）操作 a 安瓿管 需能承受大温差而不至于破裂，加棉塞后灭菌，烘干后备用。 b 菌种准备及分装 超低温