第十四章__免疫学检测技术探索.ppt

化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。 化学发光 一些化学反应能释放足够 的能量把参加反应的物质激 发到能发射光的电子激发态， 若被激发的是一个反应产物 分子，则这种反应过程叫直 接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A十B C* C* C＋ h·γ 其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态。 发光免疫分析技术（Luminescent immunoassay，LIA） 1. 原理： （1）LIA：在氧化还原反应中电子被激发，可释放光子，使发光剂鲁米诺（氨基苯二酰肼类）发光。用发光剂标记抗原或抗体 （2）发光酶免疫测定（LEIA）：用能催化发光反应的酶（如葡萄糖氧化酶）标记抗原或抗体，酶可使发光剂发光。该法经酶促放大，更灵敏. 根据发光的强弱对抗原或抗体定量. 2. 优点： 无放射性，故现正逐步取代 RIA 用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。 直接化学发光免疫分析 发光 Y Y Y 磁微粒 被测抗原 + 抗体 + 带丫啶酯标记物抗体 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 冲洗后 --- 夹心法 （1） 加入H2O2 （pH10） （2） 加入碱 （pH10） 直接化学发光的机理 磁微粒模式图 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 特点 已结合的抗原和抗体与未结合部分的易分离 磁微粒技术 第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用 ELISA 基本原理 碱 性 磷 酸 酶 或 过 氧 化 物 酶 第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用 酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 二、ELISA的种类 P320 直接法测定抗原 间接法测定抗体 双抗体夹心法测定抗原 双抗原夹心法测定抗原 竞争法测定抗原 第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用 第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用 二、ELISA的种类 双抗原夹心法测定抗原 第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用 二、ELISA的种类 双抗体夹心法测定抗原 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体， ②酶标记的抗原或抗体， ③酶作用的底物。 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 　 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 　　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 　　（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 　　（3）加酶标抗体： 　（4）加底物： （一）双抗体夹心法 　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 　　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体： 　　（2）加受检标本： 　　（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 　（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 二、ELISA的种类 双抗体夹心法测定抗原 三、抗体的酶标记 P321 ? 戊二醛法 ? 过碘酸盐氧化法 第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用 第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用 四、酶与底物 酶与抗原、抗体或半抗原在交联剂作用下