电泳八年制(法).pptVIP

原理： 蛋白质是两性电解质 蛋白质由于等电点的不同而带有不同的电荷性质。在电场下发生移动，当它们达到净电荷为零时停止迁移，分别聚焦在各自等电点相应的pH位置，这种行为称为聚焦反应。 蛋白质在等电聚焦电泳中的分离仅仅决定于其等电点，达到稳态后，如果它要正极或负极任何一侧扩散，均会受到相应的pH制约，迫使其扩散后退回原位。因此，蛋白质能在等电点位置被聚焦成一条稳定的窄带。 分辨率高，有浓缩效应。 等点聚焦特点 在等电聚焦电泳中，分离是在连续的pH梯度中进行的，用两性电解质建立电场中连续线性pH梯度。 只适用于两性解离的物质电泳 以聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophorsis，简称PAGE)为电泳支持物,分辨率高 用于分离、鉴定蛋白质 pH梯度的形成 载体两性电解质定义：许多异构体与同系物的混合物，化学本质是多羧基多氨基脂肪族化合物，具有连续的PI值。 在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH约为6.5左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷,只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零. 引入电场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在分子净电荷为零的位置停止迁移. pH梯度的形成 靠近阳极端的载体两性电解质,电负性最强,具有较强的缓冲氢离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阴极顺延; 靠近阴极端的载体两性电解质,电正性最强,具有较强的缓冲氢氧根离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阳极顺延。 在正极注入酸液如：硫酸，磷酸；负极注入碱液如NaOH，避免样品和两性电解质载体在阳极氧化，或在阴极还原。 加 酸 加 碱 pI 小 大 关键是形成pH梯度 pH 低 高 理想的两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 两性电解质载体的pI愈连续，形成的pH梯度愈平滑。 pH梯度的形成： Ampholine(瑞典LKB) 它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的, 具有连续的氨基羧基比，pH范围3.5-10. 分子量300-1000 280 nm紫外吸收低 抗对流支持介质：聚丙烯酰胺凝胶（PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-甲叉双丙烯酰胺(N,N’-methylenebi sacrylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophorsis，简称PAGE)。 反应方程式： 聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。 单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素； 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶 AP-TMTED催化体系： TMTED是一种脂肪族叔胺， ·TEMED催化AP生成硫酸自由基： S2O82－ → 2SO4·ˉ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： 影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素 试剂的纯度 温度 氧气 〔AP〕〔TEMED〕原则：尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合。 聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的优点： 分辨率高，几乎无带电基团，电内渗小。 化学惰性强，稳定性好，亲水性好。 具有很好的光学透明度和一定的刚性。 抗对流和扩散。 具有可控的孔径大小。 样品的预处理 盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行IEF时，样品应透析或用Sephadex G-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。 为提高疏水蛋白在水中的溶解度，可添加尿素，无离子/两性离子去污剂。 加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250染色，加样量可为50-150 ?g；一般