2-定量PCR-2014详解.ppt

相对定量分析方法 相对定量分析方法 目的基因与内参基因的扩增效率是否相近(≤5%)? NO YES ??Ct method 双标准曲线法 相对定量分析 双标准曲线法: 目的基因与内参基因扩增效率不同 相对定量分析 双标准曲线法: 相对定量分析 ? ? CT 法 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在 5％以内 相对定量分析 实验步骤 目的基因GAPDH样品做五个浓度稀释，做标准曲线 DNA浓度测定 0.025 ng/ul 质粒DNA ①依次4倍稀释 样本稀释： A样本：将①稀释4倍 （取① 4ul +12ul ddH2O ） B样本：将A样本稀释4倍 （取A样本4ul +12ul ddH2O ） C样本：将B稀释4倍 （取B 4ul +12ul ddH2O ） D样本：将C样本稀释4倍 （取C样本4ul +12ul ddH2O E样本：将D样本稀释4倍 （取D样本4ul +12ul ddH2O 参比荧光按照不同品牌/型号Q-PCR仪稀释添加或不加 TaKaRa QPCR试剂盒 质粒DNA 4ul SYBR mixture 10ul RoxII 0.4ul GAPDH引物（2uM) 2ul dd H20 3.6ul total 20ul 步骤: 95℃ 5min 95℃ 5s 57℃ 15s 40cycle 熔点曲线 95℃ 1min 57℃ 30s 95℃ 30s 上机 在做荧光定量实验时要注意些什么呢？ 为确保实验数据的有效性，每个样品都平行做2个复孔。 在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式），并不能用手直接触摸毛细管、离心管吗底部。 操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。 配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。 Roche LightCycler 480II 实时荧光定量PCR系统 高通量 ：检测96或384孔板样品 高灵敏度：可检测单拷贝基因 技术创新：采用Therma-BaseTM热循环专利技术和先进的光学检测系统，彻底消除边缘效应，保持稳定优异的检测结果 全能：分析模式多样，绝对定量、相对定量、基因分型（溶解曲线法和终点法）、高分辨率溶解曲线分析，同时适用几乎所有检测模式 高分辨率熔解曲线 高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是一种基于单核苷酸溶解温度不同而形成不同形态溶解曲线的基因分析新技术 具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作 在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技术发挥着重要作用 * * 荧光定量PCR和常规PCR技术的区别常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确）；荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法（准确定量） 。 所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 * 在每个扩增循环由于切开了探针