【大学课件】常用分子生物学技术概述.pptVIP

一、分子生物学技术在新药研究中的应用 1.生物技术药物 2.靶向制药 3.抗体工程制药 4.药物筛选 二、常用分子生物学技术 1.基因重组 2.PCR技术 3.分子杂交技术 4.基因芯片技术 （一）基因重组 基因重组（DNA Recombinant），也称基因克隆（Gene Cloning）,指在生物体外对不同来源的DNA 分子进行剪切和连接，形成新的重组DNA分子并将其导入受体细胞，使其在细胞中稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA。 1.目的基因的制备 目的基因又称外源基因，即我们感兴趣的待研究基因，其表达产物可能有较大的经济或社会效益。主要来源于各种生物。人、动植物染色体；线粒体、叶绿体。 2.用限制性内切酶切割目的基因和载体 载体（Vector）:指能够将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具。其本质是DNA。常用载体有质粒载体、噬菌体病毒载体或染色体DNA改建成的载体。 工具酶：DNA重组包括分子切割及连接等需要多种不同功能的工具酶参与完成，如限制性内切酶、DNA连接酶（“分子针线”）、DNA聚合酶等。 3.用DNA连接酶连接酶切后的目的基因和载体，构建DNA重组子 连接方法：粘末端连接、平末端连接、同聚物加尾连接、人工接头连接、衔接物连接法。 4.将DNA重组体导入宿主细胞 目的基因序列和载体连接后，要导入细胞中才能繁殖扩增，在经过筛选，才能获得重组DNA克隆。不同载体在不同宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相同。方法有转化、转染、感染、显微注射等。 5.重组体的筛选鉴定 将众多的转化菌落、噬菌斑或细胞区分开，并签定其缺失含目的基因的重组体的过程称为筛选。 目的基因和载体重组进入宿主后，由于操作原因或不可预测的干扰等，目的序列与载体正确连接的效率和重组导入细胞的效率都不是100％，因此最后生长繁殖出来的细胞并不都带有目的序列，真正获得目的基因并能有效表达的克隆分子知识其中一小部分，绝大部分仍是原来的宿主或不含目的基因的重组体。 6.目的基因在宿主细胞中扩增和表达 指被克隆如某一载体的目的基因经转录和翻译生产蛋白质的过程。某些具有特定生物活性的蛋白质在医学或工业上都有很大的价值。如疫苗、干扰素等。 （二）PCR技术 包括三个步骤： ①模板DNA的变性（denaturating） ②模板DNA与引物的退火(复性)(annelling) ③引物的延伸 (extension) 设计原则： ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物不能形成二级结构。③ 引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不可修饰。⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。 (三) 分子杂交技术 1.基本原理 核酸分子杂交的基本原理：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。 2.常见杂交方式 (1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。 　(2) Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。 (3) Western 杂交：蛋白质分子检测 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因 此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。 3.分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 (1)Southern blotting 1975年，英国Edwen Southern创建 检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析、基因诊断、分子克隆、法医学等 Southern bloting的主要步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)： 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测 核酸的分子杂交 将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结