核酸分离提取技术试题.pptVIP

* 磁珠法主要原理 通过细胞裂解液裂解细胞，游离出的核酸分子被特异吸附到含硅胶膜的磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中 在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，回收磁珠-DNA 混合物，再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA 8. 常用植物总DNA提取方法及主要原理 * 硅膜吸附法主要原理 在离液盐的作用下，水的结构发生改变，帮助核酸结合到硅胶膜上，而在无离液盐的作用下，则将核酸进行洗脱 8. 常用植物总DNA提取方法及主要原理 * 9. RNA提取 RNA实验的关键是分离得到全长的RNA 实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染 RNA酶广泛存在而稳定、一般反应不需要辅助因子。 可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等 2. RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,少量RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解 难点：一、严格控制外源性RNA酶的污染??? 外源性的RNA酶：操作人员的手汗、唾液等，灰尘等。外源性RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽等 二、最大限度地抑制内源性的RNA酶 各种组织和细胞中含有大量内源性的RNA酶 RNA提取的难点 * 1. 杜绝外源酶的污染 严格戴好口罩，手套  实验涉及离心管、Tip 头、移液器、电泳槽、实验台面等要彻底处理  试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free2. 阻止内源酶的活性  选择合适的匀浆方法和裂解液  控制好样品的起始量3. 明确自己的抽提目的  任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。  RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率 防止RNA酶污染的措施 9. RNA提取 * 防止RNA酶污染的措施 1.??设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用 2. 所有玻璃器皿在使用前于180℃高温烘烤6hr或更长时间 3.??塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗 （注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用） 4.?有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再 浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干 5.??配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。 然后用高压灭菌除去残留的DEPC。 不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22μm滤膜过滤除菌 6.?操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换 9. RNA提取 * 焦磷酸二乙酯（DEPC） 一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性 异硫氰酸胍 目前认为是最有效的RNA酶抑制剂，在裂解组织的同时也使RNA酶失活,既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用氧钒核糖核苷复合物 由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin） 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活 其它 SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用 常用的RNA酶抑制剂 。 9. RNA提取 * 1. 样本前处理 选择新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织 处于生长旺盛的时期收集细胞、新鲜血液，不得超过4小时 液氮或加入RNase抑制剂保存, 避免反复冻融， 推荐使用专门的RNA样品储存液储存 2. 细胞裂解 异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂 胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒 独特配方—RNA plant植物RNA提取试剂 3. RNA的纯化及获得 纯化后不应存在对酶 (如逆转录酶) 有抑制作用物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 排除DNA分子的污染 10. RNA提取流程 * 几种RNA提取方法 1. TRIzol法 TRIzol的主要成分:异硫氰酸胍和酚 异硫氰酸胍：解偶剂，一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放 酚：有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性 TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase