蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸相互作用学案.ppt

蛋白质－蛋白质、蛋白质－核酸相互作用研究方法及在人肠道病毒A71型研究中的应用 汇报人：排孜丽耶 杨涛 祖丽皮亚 游西龙 人肠道病毒71型（EV-A71） 蛋白质－蛋白质相互作用的研究方法 蛋白质－核酸相互作用的研究方法 相互作用方法在EV－A71研究中的应用 报告内容 人肠道病毒71型为小ＲＮＡ病毒科肠道病毒属成员，是引起婴幼儿手足口病的主要病原体之一，还可以引起与神经系统相关的脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经源性肺水肿等临床症状。 1 人肠道病毒71型（EV-A71） 酵母双杂交(Y2H) 免疫共沉淀(Co-IP) 亲和印迹 病毒铺覆蛋白结合技术(VOPBA) 荧光共振能量转移(FRET) 2 蛋白质－蛋白质相互作用的研究方法 酵母双杂交(Y2H) 免疫共沉淀(Co-IP) 亲和印迹又称为蛋白质铺覆技术，与ＶＯＰＢＡ均是基于ＷＢ的技术，运用经标记的或可被抗体检测的“诱饵”蛋白检测转移膜上的“猎物”靶蛋白。如果“诱饵”蛋白与靶蛋白存在相互作用，那么利用该“诱饵”蛋白的特异性即可检测出相应条带。两者其实在本质上是相似的，只是ＷＢ是直接用抗体去检测抗原，常用于蛋白质定性；而亲和印迹则是用标记的蛋白或病毒溶液去探查与之相互作用的蛋白，或再用抗这种蛋白或病毒的抗体显示这种蛋白的结合位置，用于研究蛋白质的相互作用。这两个技术操作过程和ＷＢ相似，操作简单易行，缺点是由于经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，蛋白构象可能发生变化，影响蛋白质相互作用。 亲和印迹 和 病毒铺覆蛋白结合技术(VOPBA) FRET技术广泛用于研究分子间的距离及其相互作用，与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA的时空信息。FRET是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。优点是随着绿色荧光蛋白的发展，FRET荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。 荧光共振能量转移(FRET) 酵母单杂交（Y1H) 染色质免疫沉淀(ChIP) 电泳迁移率实验(EMSA) DNA-蛋白质印迹 Co-IP 3 蛋白质－核酸相互作用的研究方法 酵母单杂交（Y1H) 酵母单杂交是根据酵母双杂交技术的原理提出的，用于研究DNA-蛋白质之间的相互作用。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区（BD）和转录激活区(AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。 染色质免疫沉淀（ChIP） 　ChIP是研究体内蛋白质与基因组ＤＮＡ相互作用的一种技术。在生理状态下把细胞内的ＤＮＡ与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的ＤＮＡ 片段沉淀下来。该技术优点是可以在体内进行反应，缺点是对实验条件如抗体和缓冲液等实验条件要求较高。 　　ＥＭＳＡ基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。该方法可用于检测ＤＮＡ 结