蛋白质组学方法学案.pptVIP

iTRAQ操作流程 2. 蛋白质的分离 iTRAQ技术特点 通量高：可一次实现最多8次样品的分离分析 重复性好且定量准确：所有样品的分离鉴定条件完全一致，保证了实验重复性，同时增强定量的准确性 分辨率高：可与最高分辨率的LC-MSMS技术结合，实现对低丰度蛋白的定量定性 数据丰富：可以获得检测到的所有蛋白的定性和定量信息 自动化程度高：以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快 2. 蛋白质的分离 质谱（MS）鉴定 质谱仪：能够测量真空中离子的质荷比（m/z）的仪器 根据m/z可以准确确定待测样品的分子质量，从而确定其分子组成 质谱仪的主要构成 3. 质谱分析鉴定 蛋白质组学中常用的质谱仪 ESI-三重四级杆 MS LC-ESI-MS/MS MADLI-TOF (/TOF) MS：价格便宜，应用最广泛 Orbitrap MS：新技术，更高的质量分辨率和质量精度 3. 质谱分析鉴定 质量指纹图谱 肽质量指纹图谱（PMF）：蛋白质被具有特异性切割位点的蛋白酶降解后产生的多肽的质量通过MS进行测定得到MS图谱。由于每个蛋白质所含氨基酸序列不同，因此其PMF也是独一无二的。 MS/MS(串联质谱) 蛋白鉴定：在PMF基础上选择部分片段进行破碎并获得碎片质量图谱与理论图谱进行比较实现蛋白匹配鉴定。 3. 质谱分析鉴定 基于质量指纹图谱鉴定蛋白质 通过将实验测得的质量图谱在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似肽谱的蛋白质。 3. 质谱分析鉴定 数据库检索 3. 质谱分析鉴定 检索工具软件：Mascot，Profound，PeptIdent，PepSra等 数据库：NCBI、SWISS-PROT、UniProt、Integr 8等 数据库检索 检索工具软件：Mascot，Profound，PeptIdent，PepSra等 数据库：NCBI、SWISS-PROT、UniProt、Integr 8等 3. 质谱分析鉴定 数据获得 3. 质谱分析鉴定 Thanks for your attention！ XXXX 2015-11-27 蛋白质组学研究方法 1. 蛋白质组学简介 概 要 3. 质谱分析鉴定 2. 蛋白质的分离 组学时代（Age of omics） 1. 蛋白质组学简介 从基因组学到蛋白质组学 1. 蛋白质组学简介 什么是蛋白质组（学）？ 蛋白质组(proteome = protein + genome)：一种细胞、组织或生物体所表达的全套蛋白质，具整体性和动态性。 蛋白质组学(proteomics) ：研究细胞组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。 1. 蛋白质组学简介 Tip：蛋白质组学是研究领域和方向，也是研究工具和策略 蛋白质组学研究思路 表达蛋白质组 功能蛋白质组 蛋白质与蛋白质的相互作用 结构蛋白质组 蛋白质组与基因组、转录组、糖组、代谢组间的相互关系 1. 蛋白质组学简介 蛋白质调控及功能实现的复杂性 mRNA Protein Ribosome DNA Polypeptide tRNA 1. 蛋白质组学简介 蛋白质组学研究特点 1. 蛋白质组学简介 蛋白质组学研究内容 1. 蛋白质组学简介 蛋白质组学研究常用技术 1. 蛋白质组学简介 蛋白质的分离策略 2. 蛋白质的分离 总蛋白质的提取（植物） 三氯乙酸（TCA）-丙酮法 苯酚法 裂解液法 尿素/硫脲法 KCl-醋酸铵甲醇法 改良丙酮沉降法 硫酸铵沉降法 直接提取法等 …… 2. 蛋白质的分离 等电聚焦（Isoelectric focusing, IEF） 原理：根据蛋白质的等电点进行蛋白分离 2. 蛋白质的分离 固相pH梯度(Immobilized pH gradiet, IPG)胶 在IPG胶中，丙烯酰胺缓冲液通过乙烯键共价聚合至固体凝胶聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可进行稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。 丙烯酰胺缓冲液: CH2=CH-CO-NH-R, R ：羧基或叔胺基 固相凝胶 2. 蛋白质的分离 不同pH和长度的IPG胶（以BIO-RAD的ReadyStrip? IPG 胶条为例） 相对聚焦功率表示在使用不同长度或 pH 范围的 IPG 胶条时，在第一维中预期获得的增强的分辨率。 为 7 cm pH 3–10 IPG 胶条任意分配基线聚焦功率 1.0 以便计算其他胶条的相对聚焦功率 2. 蛋白质的分离 宽pH、窄pH 范围胶条 宽pH梯度胶条应用： 整个蛋白图谱 窄pH梯度胶条应用： 提高分辨率 增加样品上样量 检测分析更多蛋白 2. 蛋白质的分离 SDS(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳) 根据蛋白质的分子量进行蛋白分离。 同普通SDS类似，只是一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶