3-核酸-蛋白技术解说.ppt

第三章 核酸蛋白分析原理与技术 第一节 核酸分析技术 讲述内容： 1、核酸电泳 2、杂交技术 3、PCR技术 4、基因芯片 一、核 酸 电 泳 （一）DNA的凝胶电泳 凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 用于核苷酸多态性的分析 琼脂糖凝胶电泳的基本过程 材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。 基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果 注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： 1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液 特殊的凝胶电泳 倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分离分子量10～2000kb的DNA分子； 钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可分离大于107bp的DNA分子 （二）RNA 电 泳 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 二 核酸杂交技术 （一）Southern Blot 原理： （二）Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 （三）探针标记技术 1 标记物：放射性和非放射性两种 放射性： 非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 2、标记方法 （1）切口平移法 （2）随机引物法 （3）末端标记法 （4）单链DNA探针标记 （5）寡核苷酸探针标记法 三 PCR技术 PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖； PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 Pfu DNA 聚合酶 耐热 5’?3’DNA聚合酶活性 3’→5’外切酶活性 精确度：Pfu Taq 但Pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果 （三）PCR技术的应用 1. 基因检测： 2. 基因克隆化 3. DNA突变 4. DNA序列分析 四、基因芯片 利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究 操作流程 （1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）； （2）靶基因样品的制备； 靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组） 标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5 （3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似 封闭 预杂交 杂交 洗脱 （4）杂交信号的检测与结果的分析 激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析 基因芯片的应用 用于基因转录水平的检测、基因组