Elisa法检测人瘦素Leptin浓度.docVIP

双抗体夹心ELISA法检测样本中Leptin 的浓度 Leptin简介： 人的瘦素蛋白是一个16KDa 的多肽激素，主要由脂肪细胞释放，其主要作用是调控食欲的降低和能量消耗。但是，人们还发现瘦素蛋白在血管再生、骨代谢、造血及免疫调节上有重要的作用。 瘦素可与丘脑下部的中央脊腹部的饱觉中枢结合，从而使得大脑得到食物充足的信号，这样瘦素的表达水平的高低就可达到调控能量摄入和机体的能量消耗作用。 瘦素功能的实现主要跟瘦素受体结合后实现的，瘦素受体有两类，一类是固定细胞膜上的受体，主要通过JAK/STAT信号通路起作用，另一类是游离的受体，这类受体一般是丢失了受体的细胞膜内的部分，游离出来的，根据失去的结构不同，游离受体的种类较多。人体内游离的受体的产生主要是由金属蛋白酶介导晚期肾病: 本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中Leptin 的浓度。Leptin 捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的Leptin 会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人Leptin 抗体后，抗人Leptin 抗体与Leptin 接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在Leptin 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，Leptin 浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中Leptin 浓度。 实验过程需自备的材料： 1.不同规格的加样枪及相应的枪头； 2.酶标仪； 3．自动洗板机； 4．去离子水或双蒸水； 注意事项: 1.试剂盒请保存在2～8℃。 2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。 3.若标准品复溶后，请在三天内用完。 4.底物请勿接触氧化剂和金属。 5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。 6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。 7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。 8.室温反应，请严格控制在25～28℃。 9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。 10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。 11.加样过程中避免气泡的产生。 12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。 标本收集: 1.标本的收集请按下列流程进行操作： A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可； B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液； C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集； D.标本收集后请分装，若待测样本不能及时检测，冻存于－20℃，避免反复冻融。 2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂； 3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除； 4.请勿使用溶血高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。 注：正常人血清或血浆样本请用标本缓冲液做倍比稀释后再检测。 检测前准备工作: 1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。 2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释 1份加19份水 。 3. 标准品:加入去离子水0.25ml至冻干标准品瓶中使leptin终浓度达到2000pg/ml，静置15分钟后轻轻混悬待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.） 洗涤方法: 自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。 操作步骤: 1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。 2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。 3.分别将标本或不同浓度标准品 100ul/孔 加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。 4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。 5.加入生物素化抗体工作液 100ul/孔 。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育60分钟。 6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。 7.加入酶结合物工作液 100ul/孔 。