荧光分光光度计试题.pptVIP

荧光分光光度计 当激发光照射某些物质时 ,处在基态的分子吸收激发光后跃迁为激发态 ,这些激发态分子在因转动 、振动等损失一部分激发能量后 ,以无辐射跃迁下降到低振动能级 ,再从低振动能级下降到基态, 在此过程中激发态分子将以光的形式释放出它们所吸收的能量,这种光称之为荧光,所得到的光谱称为荧光光谱。荧光光谱能够反映荧光物质的特性。荧光分光光度计是基于物质的这种性质而对其进行定性及定量分析的一种分析仪器。 荧光定量分析的数学处理比分子吸收光谱复杂。一般来讲: 如果荧光物质的浓度足够低 ,则 If =2.3 φf I0εbc =kc 。这就是荧光定量分析的理论公式, 式中 ε、b 、c 分别是摩尔吸光系数 、液池厚度及被测物质的浓度。 基本原理 荧光辐射是从样品发生的 ,其在所有方向发射都相同 ,原则上可以从任何角度进行观测 。但从仪器设计和应用的观点来看, 90°角度是最方便且是目前使用较为广泛的方式。 荧光分光光度计的基本结构是 : 光源 →单色器或滤光片→样品池→单色器或滤光片→检测器。 目前荧光分光光度计的常用光源为氙灯,单色器多用光栅 ,检测器主要用光电倍增管,普通荧光分光光度计的激发和发射波长一般在 200～ 900 nm 。 基本结构 光源： 光源应具有强度大、适用波长范围宽两大特点,常用光源有高压汞灯、氙灯、氙-汞弧灯等。此外，紫外激光器、固体激光器、高功率连续可调染料激光器和二极管激光器等荧光光源把荧光法的应用范围拓宽。 滤光片和单色器： 在荧光光度计中，通常采用干涉滤光片和吸收滤光片作为激发光束和荧光辐射的波长选择器。在荧光分光光度计中至少选用一个，而常常是用两个光栅单色器，且均带有可调狭缝，以供选择合适的通带。理想的单色器应在整个波长区内有相同的光子通过效率，不幸的是这种理想的单色器不存在。 检测器： 一般普通的荧光分光光度计均采用光电倍增管作为检测器。它是很好的电流源，在一定条件下其电流量与入射光强度成正比。此外，还有光导摄像管、电子微分器、电荷耦合器阵列检测器。 理论上，具有刚性结构和平面结构的分子；π电子共轭体系的分子；给电子取代基的化合物都可用直接荧光法测定。间接荧光法测定是目标分析物本身不具备荧光发射能力,但具备使某种荧光物质荧光猝灭的能力,或者可以通过氧化还原偶联酶催化等手段使其转化为荧光物质,而进行间接测定。 多种氨基酸的分析、在肌肉和心脏疾病中非常注意细胞内离子浓度的测定；核糖核酸（R N A ）和脱氧核糖核酸（DNA ）的相关研究，如 DNA 、R N A的检测和定量，用以鉴别病毒细菌等的 DNA/酶相互作用研究，DNA 密码的改变导致癌症病因研究，能断裂DNA 限制酶测定，荧光PCR(DNA 的放大)的研究等;蛋白质和酶的作用研究，如DNA 的表达、细胞膜流动性及细胞膜内蛋白质研究、涉及抗体、蛋白质和酶的ELISA 测定研究、酶活性测定等。尤其是各种新型蛋白和核酸荧光标记物的引入，各种荧光酶联免疫分析技术 、偏振荧光测定技术以及为克服生物样品紫外区背景荧光和散射光的严重干扰而提出的近红外区荧光测定技术的发展，为医学和生命科学领域提供了丰富的研究手段。 生命科学及其相关领域的应用 （1）灵敏度高 比紫外/可见光分光光度法高2~4个数量级，为什么? 分光光度法所检测的是两个较大信号的微小差别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱 （3）试样量少 （4）可提供比较多的物理参数 缺点：应用范围小 特点 标准曲线法定量: 配置一系列的标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线。再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。 比较法定量： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。 定量方法 操作步骤 开机：接通电源,打开主机开关,点燃(打开)光源后,根据说明书要求启动计算机. 检测前准备：参照仪器说明书,在20天内至少进行一次激发校准和发射校准,检测前仪器应预热. 工作条件的选择：环境温度应在20℃±5℃;相对湿度不大于70%;电源稳定,无磁场、电场干扰.根据样品的特性及荧光强度,选择合适的仪器工作条件(如狭缝、PM增益、响应时间等). 基本测定 注意事项 在实验开始前,应提前打开仪器预热,并配制好所需的溶液,对于已经配制好的溶液,在不用时放在4℃冰箱中保存,放置时间超过一星期的溶液要重新配制. 实验所用的样品池是四面透光的石英池,拿