细胞培养第四章基本技术和方法.docVIP

第四章 细胞培养的基本技术和方法 一、原代取材的基本要求 1、无菌 2、取材器械要锋利 3、及时培养：组织块＜1cm3，尽快培养；若延时，4℃冰箱＜24h。 4、剔除与细胞培养无关的成分 5、营养成分：最好用胎牛血清 10~20％浓度 6、注意保存原代组织的相关信息。 二、组织细胞的分离 1、细胞悬液的分离 ①材料：血液、羊水、腹水等 ②500~1000r/min，低速离心5~10min 2、组织块分离 ①机械分离法： 3~5mm组织块→80目筛网→150目筛网→收集培养 ②剪切分离方法： 将组织剪成1mm3左右培养 3、消化分离法（胰酶？） 三、原代细胞培养技术 原代培养：又叫初代培养，是从供体进行细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。 织块培养法：剪切→接种于培养瓶 1mm3大小组织块→均匀摆放在培养瓶壁上→25ml培养瓶以20~30块为宜→翻转培养瓶，使瓶底朝上，加入少量培养基，置37℃温箱→2~4h后，将培养瓶翻转平放，静置培养 注意：①轻拿轻放，避免组织块漂移 ②前1~2天注意是否有污染 ③3-5天后换液一次。 消化培养法 按消化分离法获取细胞→800~1000r/min离心5min。弃上清液，并加培养基→接种于培养瓶，置5％CO2温箱孵育。 四、传代培养技术 （一）贴壁细胞的传代 吸或倒出就培养液，PBS/Hanks洗2-3次 加少许消化液（胰酶200-500μL