专题52《多聚酶链式反应扩增DNA片段》汇总.ppt

1.理解PCR的原理和反应过程。(重、难点) 2．尝试PCR技术的基本操作。 3．说出PCR技术的应用。 一、PCR扩增的原理及条件 1．概念：PCR即__________________，是一种________迅速__________的技术。它能以极少量的________为模板，在短时间内复制出上百万份的________。 2．原理 (1)DNA的热变性：在__________的温度范围内，DNA___________结构解体，________分开，这个过程称为________。当温度缓慢________后，两条彼此________的DNA链又会重新结合成________。 (2)子链的合成：①需要______________；②合成方向总是从子链的______________。 3．条件 (1)________模板。 (2)分别与模板DNA相结合的两种________。 (3)A、T、G、C四种_____________。 (4)________DNA聚合酶。 (5)需要稳定的________和能严格控制________的温控设备。 二、PCR反应过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为________、________和________三步。 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与________结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于________之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈________扩增。 DNA分子能准确复制的原因是什么？ DNA分子独特的双螺旋结构为复制提供了精确的模板，通过碱基互补配对，保证了复制能够准确地进行。 一、PCR反应与体内DNA复制的比较 二、PCR的反应过程 1．变性 当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。 2．复性 温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 3．延伸 温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 如下图所示： PCR过程与细胞内DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是(　　) ①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA ②PCR过程不需要DNA聚合酶 ③PCR过程中，DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制 A．③④　　　　　 B．①② C．①③ D．②④ [解析]　PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。答案为C [答案]　C 下列操作过程的叙述中错误的是(　　) A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存 C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换 [答案]　C [解析]　为了防止外源DNA等因素的污染，PCR反应中所用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等，在使用前要进行高压灭菌；还要将所用的缓冲液和酶分装成小份；并且使用一次性吸液枪头，故A、B、D项都正确。在使用前，将PCR所需试剂从冰箱内拿出来，放在冰块上缓慢融化，则C项错误。答案为C。 (1)理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。 (2)DNA含量的测定： DNA在260nn的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下： 温馨提示：PCR扩增过程中的易错点 ①PCR过程中无解旋酶，破坏氢键需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后是DNA单链，并未分解成单体。 ②复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键，两条单链之间并未形成氢键，因此复性后，无双链DNA分子形成。 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DN