专题53血红蛋白的提取和分离汇总.ppt

一、基础知识： 1. 凝胶色谱 法的原理 2.缓冲液 3.电泳 二、实验操作——蛋白质的提取和分离 样品处理、粗分离、 纯化、纯度鉴定 样品处理 粗分离 纯化 （凝胶色谱操作） 纯度鉴定 1.洗涤红细胞时，为何次数不能过少？ 答：无法除去血浆代白。 2.洗涤红细胞时，为何离心速度不能过高，时间不能过长？ 答：会使白细胞等一同沉淀。 3.用沸水浴加热，是干燥的凝胶颗粒在洗涤液中膨胀有什么好处？ 答：节约时间；除去颗粒中可能有的微生物；排除空气。 4.向色谱柱中装填凝胶颗粒时，为何要紧密，不能有气泡？ 答：降低颗粒之间的空隙；气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗涤次序，降低分离效果。 5.凝胶色谱操作中，如果洗脱液流干，露出凝胶颗粒，怎么办？ 答：重新装填。 6.如何判断色谱柱制作成功？ 答：如果在洗脱液中，红色区带均匀一致地移动，说明成功。 7.你能描述血红蛋白分离的完整的过程吗？ 答：（1）通过洗涤红细胞，血红蛋白释放，离心等收集血红蛋白，即样品的处理。 （2）经透析去除分子量较小的杂质，即样品粗分离。 （3）通过凝胶色谱法，去除分子较大的杂质蛋白，即样品的纯化。 （4）经聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行纯度鉴定。 8.血红蛋白有什么特点？对蛋白质分离有何意义？ 答：血红蛋白是有色蛋白，因此，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色，来判断什么时候应收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 * 课题3 血红蛋白的提取和分离 磷酸缓冲液(K2HPO4/KH2PO4) 小分子，进入凝胶颗粒，路程长，运动慢； 大分子，不能进入颗粒，路程短，运动快。 带电粒子在电场中的迁移。 成分： 作用： 定义： 分类： 作用 原理 使带电粒子产生不同的迁移速度，从而达到分离、鉴定活体春的目的。 利用样品中个分子带电性质、分子大小、形状等差异，时期产生不同的迁移速度。 琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 维持pH基本不变。 红细胞的洗涤 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液 目的： 方法： 去除杂蛋白 4次低速短时间离心，除血浆 用蒸馏水和甲苯 2000r/min、 10min离心 ——磷酸缓冲液作透析液；除小分子杂质 ——透析 试剂： 方法： 交联葡聚糖凝胶 一次性缓慢倒入色谱柱 加磷酸缓冲液 （洗涤平衡凝胶） 凝胶色谱柱的制作 凝胶色谱柱的装填 样品的加入与洗脱 ——看教材69页图5-22/21 —使用最多的— SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠—能使蛋白质发生完全变性，它所带的电荷远远大于蛋白质原有的电荷量，掩盖不同蛋白的电荷差异。 凝胶色谱法的原理 *