DNA聚合酶简介详解.pptxVIP

Polymerization： 从模板链的3‘末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNA pol 逐个将寡核苷酸加上去，就是DNA pol 的聚合作用。dNTP进入结合位点后，聚合酶促进3‘-OH与5’-PO4结合生成磷酸二酯键，这一过程使酶的构象发生变化。 DNA Polymerase activities DNA polymerase moves along the old strand in the 3-5 direction, creating a new strand having a 5-3 direction. Structure of human DNA polymerase Structure of human DNA polymerase complexed TTP with manganese in the active site 3′-5′ exonuclease activity: proofreading activity: 校正作用：新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。其功能是保证DNA复制的精确性。 DNA Polymerase activities 5′-3′ exonuclease activity: 切除修复作用：从5→3方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上双链磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5→3。DNA的聚合作用能刺激5→3外切酶活力达10倍以上。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。Taq酶的5-3外切核酸酶活性只能在链延伸过程中降解遇到的双链DNA，例如，Taqman探针结合到DNA链上会被Taq酶切除。 DNA Polymerase activities DNA Polymerase families（human） families α: 定位于胞核，参与复制引发，不具5‘－3’外切酶活性families β: 定位于核内，参与修复，不具5－3外切酶活性 families γ：定位于线粒体，参与线粒体复制，不具5‘－3’外切酶活性，有3‘－5’外切酶活性 families δ：定位核，参与复制，具有3‘－5’外切酶活性，不具5‘－3’外切酶活性 families ε：定位于核，参与损伤修复（translesion synthesis，TLS)，具有3‘－5’外切酶活性，不具5‘－3’外切酶活性 商品化的DNA polymerase：主要是从嗜热古细菌中分离 Taq酶：有5‘－3’外切酶活性，错配率取决于dNTP浓度，可在3’末端加A Pfu:具有3‘－5’外切酶活性,高保真。人工体外构建体系成熟，可直接进行改造。 Miguel Garcia-Diaz, CRC Crit Rev Plant Sci. 2007 March ; 26(2): 105–122. translesion synthesis 跨损伤修复：跨损伤修复( translesion synthesis, TLS)是一类复制后修复;?最先发现于原核细胞中。当DNA链在复制过程中遇到损伤而使复制停顿时;?机体启动跨损伤修复系统以忽略存在的损伤;?继续进行DNA复制。 Priming效率： DNA Polymerase在引物3’-末端形成酶/DNA复活体并开始DNA片段的延伸的过程称为Priming。提高其效率可使扩增特异性大幅提升。 缺口平移（Nick translation）： DNA聚合酶活性和5‘→3’外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。 当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNA poI 能从切口开始合成新的DNA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。 specific action DNA聚合酶的改造方法： 1. 酶活性中心稳定化：通过定向结构修饰来提高酶活性中心区域的刚性 保持酶活性中心原有骨架基础上，提高其内部二级结构稳定性 2.延伸因子和特异Priming： 人工合成酶-延伸因子复活物，在复活物的前端加上特异的priming区域 提升延伸性和反应速度，提高特异性的priming 3.热启动抗体： 通过制备酶抗体，形成抗原抗体复合物，使得酶在较高的温度得以释放发挥聚合活性，实现热启动PCR. 是提高PCR灵敏度和特异性的重要方法之一. 4.蛋白Sso7d的DNA结合域融合到DNA聚合酶中 Sso7d蛋白为嗜热硫化裂片菌中的一种耐热的DNA结合蛋白，其对双链DNA有较强的亲和力，可