多聚酶链式反应扩增DNA片段教程方案.ppt

多聚酶链式反应扩增DNA片断 细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 体内DNA的复制 体外的模拟 模板（母链） 细胞内源 外源加入 引物 引物合成酶 外源加入 底物dNTP 细胞内源 外源加入 聚合酶 细胞内源 外源加入 反应环境 细胞内环境 缓冲液 PCR仪 微量离心管 微量移液器 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步 ：加热变性 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 循环次数 DNA数量 1 2 2 4 3 8 20 1,048,576 30 1,073,741,824 3、30次循环后靶序列扩增的数量 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94°C，10min － － 30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 72℃，10min ④计算 DNA含量（ ?g ）＝50 x (260nm的读数）x 稀释倍数 50：1 ?g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02 比色杯 葡萄RS基因的RT-PCR扩增 葡萄RS基因的RT-PCR扩增图谱 M. DNA Marker 2000；1.RS 基因 约1300bp 实验小结 PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 模板 互补 Taq聚合酶 四种脱氧核苷酸 引物 变性、复性和延伸 72℃