高级生物化学chapter06techniquesforexploringgenes(inChinese)教程方案.pptVIP

第六章 基因研究技术 主要内容： 本章主要讨论基因研究技术中的限制酶 类；DNA克隆；克隆了的基因的表达；基因工程。 目录 6.1 限制酶类 6.2 DNA测序 6.3 DNA克隆 6.4 克隆了的基因的表达 6.5 基因工程 6.1 限制酶类 能识别4~8个碱基对的特异序列 都切割对称轴的3′-端的C-G磷酸二酯键 识别序列是回文结构 链霉菌(Streptomyes achromogenes)的一种限制酶所识别的序列为 限制酶命名 它们的名字由三字母缩写组成: 宿主生物 +菌株代号 +一个罗马数字 如：EcoRI Eco代表大肠杆菌Escherichia coli 限制酶特异性 几种这样的酶的特异性 其切割下的片段有的是交错的, 有的是平齐的 限制性片段能通过凝胶电泳分离和显色 原理： 一个DNA片段的电泳迁移率在一定范围内与其碱基对 数量的对数成反比 分类： 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 染色 溴乙锭(Ethidium bromide)，与双螺旋DNA结合时能发出强烈的橙黄色荧光 Southern印迹 一个含有特异序列的片段可以通过对片段混合物电泳、转移到硝基纤维薄膜上, 然后用32P-标记的与此序列互补的DNA探针杂交来鉴定。含有此序列的片段可用放射自显影来显现 6.2 DNA测序 Maxam—Gilbert法 Sanger 双脱氧法 DNA探针和基因可通过自动固相法合成 DNA可通过与寡核苷酸阵列(DNA芯片)杂交来测序 6.3 DNA克隆 克隆工具： 1.载体 特点:能在合适的宿主细胞中自主复制(质粒和λ噬菌体 ) 2.限制酶 此酶切割产生粘性末端 3.DNA连接酶 载体 质粒pBR322 ：插入失活-便于筛选 载体 λ噬菌体: λ噬菌体中的大片段并非是导致有效感染所必需的, 它可以被外源DNA所替换 在λ-DNA两端之间插入适宜长度的DNA(例如10kb), 使得此重组DNA分子(约为正常长度的93%)能够被装配 柯斯质粒:它能用来插入大DNA片段(大到45kb ) 基因组文库 基因组DNA →限制酶部分消化 →连上人工合成的接头形成粘性末端 →插入到载体→感染细菌→构成一个基因组文库 筛选 筛选过程可以通过DNA杂交来实现 通过放射性的cDNA或RNA分子作为探针来杂交检测 也可根据其部分氨基酸序列制作探针 染色体步移 　PCR PCR循环包含三步 解链(变性) 引物的杂交(退火) DNA合成(延伸) PCR应用 医学诊断 法医学 分子进化 从mRNA制得的cDNA可在宿主细胞中表达 免疫化学筛选法 ： 　　　有蛋白质表达且有相应抗体可用时才能使用 插入真核细胞中的新基因可以有效表达 重组DNA分子导入动物细胞方式： 1.磷酸钙沉淀 2.微注射 3.病毒携带 转基因动物能携带及表达导入其生殖细胞的外源基因 肿瘤诱导(Ti)质粒可用于将新基因导入植物细胞 新奇蛋白可通过定点突变而工程化 1.点突变 重组DNA技术打开了新的前景 * * Southern 印迹 质粒pBR322的遗传图 λ－噬菌体的一个突变体可以用作克隆载体 从整个真核基因组的消化产物制作基因组文库 染色体步移技术 大片段：插入100至1000kb 　　长段未知DNA区域可用一个已知序列经亚克隆和重筛选来研究 　　　新的探针是以已经确定的DNA序列为基础设计的 聚合酶链式反应(PCR) 胰岛素前体胰岛素原通过遗传工程改变了的大肠杆菌转化克隆来生产 使用反转录酶经mRNA合成cDNA双链 通过特异抗体显色筛选表达载体产物 大鼠生长激素基因插入到质粒上小鼠金属硫蛋白启动子后 农杆菌含有能将外源基因转移到某些植物中去的Ti质粒 外源DNA可通过电穿孔法导入植物细胞 寡核苷酸诱导的定点突变 2.盒式突变 *