动物基因组dnarna提取及含量测定指导教师.pptVIP

动物基因组DNA/RNA 提取及含量测定 指导教师:王国彦 目的要求 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术 了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点 学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法 实验原理 核酸和蛋白质是构成生物有机体的主要成分；核酸是生命的最基本物质。在生物体中它们结合成核蛋白的形式存在。核酸按其化学组成可以分成两大类，一类含D-2-脱氧核糖的称为脱氧核糖核酸（DNA），主要存在于细胞核中；另一类含D-核糖的称为核糖核酸（RNA),主要存在于细胞质内；由于核酸极不稳定，在较剧烈的化学。物理因素和酶的作用下很易降解，因此在制备时应防止过酸、过碱及其它引起核酸降解的因素作用。 一RNA的提取与测定 由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异，一般有苯酚法，去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。此法较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA RNA含量测定 RNA含量的测定方法很多：紫外吸收法、定磷法、常用地衣酚测定其原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与3.5－二羟基甲苯（地衣酚）反应，在铁或铜离子催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在10-100μg/ml范围内，光吸收与RNA浓度成正比，地衣酚特异性差，凡戊糖均有些反应。 试剂和器材 材料：动物肝脏 试剂： 0.14mol/L氯化钠 标准RNA溶液： 100μg/ml 地衣酚试剂(现用现配) 80％苯酚溶液 95％乙醇 器材：匀浆器、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等 操作方法 RNA提取： 匀浆：称取3克牛肝剪碎，加20ml 0.14mol/L氯化钠溶液10000rn/min左右匀浆1分钟左右 离心：匀浆后溶液离心8000 rn/min离心7分钟，量取上清液毫升数，沉淀物留做提取DNA用 除杂质：加等体积80％酚溶液于上清液中，搅拌充分混合10－20分钟，置冰箱冷却静止30-40分钟，离心取上层水相含有RNA，弃下层酚相含蛋白质和DNA等杂质 沉淀RNA:取上层水相含RNA溶液，加入2倍体积95％冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却，至出现白色絮状物－RNA，离心8000 rn/min离心7分钟，取沉淀物 溶解：用少量去离子水（约4毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量 RNA含量测定 DNA的提取及含量测定 DNA提取 小牛胸腺，鱼类精子和植物种子的胚等含有丰富的DNA，动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白可溶于水或浓盐溶液，如1mol/l氯化钠，但在0.14mol/l氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白则在0.14mol/l氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开，分离得到DNA－蛋白 将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS)溶液，使其DNA与蛋白质分离开来，蛋白变性，冷却，离心除蛋白，加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/l，则DNA溶解，加95％乙醇沉淀DNA，即得粗DNA，也可进一步重复操作得较纯DNA. 经常采用三种方法去除蛋白 用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA 苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离心蛋白变性，因而抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来 DNA含量的测定 原理： 强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。 试剂和器材 试剂： 生理盐水 10％SDS 氯化钠 95％乙醇 DNA标准溶液：用0.01mol/lNaOH配成200μg/ml溶液 二苯胺试剂(现用现配) 器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等 操作方法 DNA的提取： 溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌全溶解后，加3毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％，边加边搅拌，放置冰箱中，静止约30分钟 除蛋白：离心上述溶液， 8000 rn/min离心7分钟，取上清液量好体积，加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/