发酵工业与发酵工程固定化酶与固定化细胞发酵答案.ppt

一、固定化酶的定义与优点 所谓固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。 固定化酶的优点： （1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。 1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因： ? 酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化， 甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。 ? 固定化后的空间障碍效应的影响。 ? 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。 ? 包埋法时被高分子物质半透膜包围。 ? 固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子 伸展变形。 ? 酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作 用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起 作用。 ? 抑制自降解，提高了酶稳定性。 酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。 酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 简单说，由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。而这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。 三、固定化酶的制备方法 固定化酶的制备方法、制备材料多种多样，不同的制备方法和材料，固定化后酶的特性不同。对于特定的目标酶，要根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法。 （1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。 （2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。 （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶的成本适中。工业生产必须要考虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的，以利于工业使用。 吸附法 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。 （1）物理吸附法 物理吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方法，如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此法进行固定化。 物理吸附法制备固定化酶，操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，故所制得的固定化酶活力较高。 （2）离子吸附法 离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。 离子吸附法所使用的载体是某些离子交换剂。常用的阴离子交换剂有DEAE-纤维素、混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、等；阳离子交换剂有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐等。其吸附容量一般大于物理吸附剂。 离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。 包埋法 包埋法是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。 共价键结合法 共价键结合法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。 （1）酶蛋白N末