5第五章PCR法获取目的基因.pptVIP

2.遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 * PCR法获取目的基因 * * PCR法获取目的基因 * A 正常人 病 人 正常 病人 PCR-RFLP法： 3.恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）的检测 限制性内切酶 Ras基因 * PCR法获取目的基因 * 突变 限制性内切酶 正常 突变 电泳 * PCR法获取目的基因 * * PCR法获取目的基因 * 4.基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 六、PCR法克隆目的基因 1.T载体克隆PCR获取的目的基因 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。 * PCR法获取目的基因 * 具有3‘-5’ 外切酶活性的DNA 聚合酶（如pfu聚合酶），其扩增的PCR 产物是平末端, 要对这种平末端的PCR 产物进行克隆, 应首先对PCR产物的3‘末端进行加A的工作。工作程序如下。 * PCR法获取目的基因 * 方案一 胶回收平末端 PCR产物 加入5μl 10×Taq DNA Polymerase Buffer、4种dNTP或dATP、2.5U Taq DNA Polymerase 加水至终反应体积为 50μl 72℃ 保温10min 纯化 PCR片段后进行TA克隆 方案二 PCR 反应（50μl 反应体积）结束以后，加入1μl 20mM dATP 和2.5U 的Taq 酶 72℃ 保温10min TA克隆 2.设计酶切位点，克隆PCR获取的目的基因 * PCR法获取目的基因 * 3’ 5’ 限制性内切酶的识别序列 目的基因的PCR片段 3’ 5’ 限制性内切酶的识别序列 经限制酶切割得到的具有粘性末端的线性载体 体外连接 获得目的基因的克隆 经限制酶切割得到粘性末端 * PCR法获取目的基因 * /pcr.html /genetics/ward/tavi/PCR.html PCR技术的网上资源 * PCR法获取目的基因 * PCR引物设计primer premier 实验技术——核酸凝胶电泳结果处理软件quantity one 作业2 回顾基因工程的技术准备：工具酶、载体、宿主 回顾基因克隆的流程：目的基因→重组分子→转化子→筛选、鉴定→功能检测→应用 * 2^30=10.74亿 * 点击左侧图片开始播放影片：从40s开始 * 广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号（就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光）。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 * Tris溶液的pH值因温度而异,温度升高1,pH值大约降低0.03个单位。 * ?Taq DNA聚合酶是嗜热性细菌Thermus aquaticus来源的热稳定重组型Taq DNA聚合酶，分子量为94 KD。扩增片段的长度可达5 kb（简单模板）。延伸速度为0.9~1.2 kb/ min（70~75℃）。该酶具有5’→3’聚合酶活性，无3’→5’外切酶活性。扩增产物具有3-dA。 * 分子信标(Molecular Beacons) ,是一种单链DNA形成的发夹结构,在其一端有一报告基团,在另一端有淬灭基团,当它形成发夹结构时,由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近,两者之间发生荧光信号能量共振转移( FRET) ,报告基因的荧光信号被掩盖。当热循环温度达到分子信标的解链温度时,其构象发生改变,能与模板结合而完全伸展成线性分子,使得FRET消失,报告基团发出荧光信号。 在第一个循环中，Amplifluor引物1与特异CDNA的第一条链退火并被Taq酶延伸。在 第二个循环中 Amplifluor