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动物实验方案 免疫原的准备 动物实验分组 免疫方法及剂量 样品采集时间及保存方法 动物实验检测指标 赵俊娜 2010-3-24 一、免疫原准备 一）、以PFBD-AP12A3C、PFBD-EGFP为载体的杆状病毒蛋白抗原准备 PFBD-AP12A3C、PFBD-EGFP感染HF细胞。175c㎡细胞瓶15瓶，收集细胞上清，用PH:7.2的PBS洗细胞两次，用细胞刮挂下来细胞并与适量的PBS 混合，-80℃冰箱。反复冻融3次。离心，8000g/min,10min.上清做蔗糖梯度超速离心：，35000转离心2.5h，脱糖，沉淀溶于无菌的PBS中。取适量做Western Blot 分析。一抗为牛血清，1/40,二抗为HRP-SPA。 蛋白浓度的确定： 二）、以Bac-VSVG-CMV-AP12A3C/YP12A3C/EGFP为载体的重组杆状病毒免疫原的准备。 高滴度病毒的获得及纯化：Bac-VSVG-CMV-AP12A3C/YP12A3C/EGFP重组杆状病毒F3代的毒感染Sf9 cell175c㎡细胞瓶20瓶，收集细胞上清。离心，12000r/min,15min.去除细胞碎片，上清转移到无菌的离心管中备用；纯化：准备35%的蔗糖垫子，25000转离心2.5h。沉淀溶于无菌的PH:7.2的PBS中。PBS的量为总病毒液体积的0.5%。BacPAK杆状病毒滴度快速检测试剂盒检测超离后的重组病毒的滴度。 二、动物实验分组情况 小鼠实验： Bac-VSVG-CMV-AP12A3C组、 Bac-VSVG-CMV-YP12A3C组、Bac-VSVG-CMV-S-EGFP组、PBS组、A型灭火疫苗组，Y型灭火疫苗组，PFBD-AP12A3C蛋白组、PFBD-EGFP组共8组，每组11只。 免疫方法及剂量 小鼠实验： 活毒方面：Bac-VSVG-CMV-AP12A3C/YP12A3C/EGFP重组杆状病毒以病毒量为1010 Pfu/ml,.接种4-6周龄Ba/c小鼠，每组11只，后腿肌肉注射，共免疫两次，间隔三周，并设PBS免疫组作为阴性对照组。 蛋白方面：32，64ug.接种4-6周龄Ba/c小鼠每组11只，共免疫两次，间隔三周，并设PBS免疫组作为阴性对照组。 四、样品采集时间及保存方法 小鼠血清样品采集及保存： 尾静脉采血：于首免后三周，六周采血。左手保定小鼠，用酒精棉擦拭小鼠尾部，轻轻地弹小鼠尾部，直到小鼠尾部充血，然后用剪刀剪断尾部。抽血泵采血300ul。37℃ ,2h。4℃过夜。12000r/min,5min。在超净台上做：吸取6ul做ElISA抗体效价检测，其余的放入在酶切管中做微量病毒中和试验。血清，-20℃保存备用。 五、动物实验检测指标 小鼠实验指标： 1、抗体水平检测（抗原为AVP1蛋白：用杆状病毒表达系统表达）间接ELiSA检测 2、微量中和抗体水平（固定病毒有限稀释血清法） 按照报道的改良的中和抗体检测方法，结合来检测免疫后第三、六周实验动物的特异的中和抗体水平。 方法：收集备检血清，56℃灭火30min,按21 ,….28 倍比稀释血清，然后将稀释好的血清分别加入96孔细胞培养板中。每个稀释度做3个重复，每空50ul，然后再在所加有血清的培养空中加入用DMEM稀释为100Pfu的FMDV A 50ul，37℃，CO2 培养箱中作用1h,然后于每空中滴加2-5×105 个/ml 的BHK-21 cell悬液100ul，轻轻摇匀后，放入培养箱内培养3-4天。观察细胞病变情况，计算备检血清中和FMDV的特异性中和抗体的滴度。 3、免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-r的分析（刺激原为AVP1蛋白）。 ⑴利用实时荧光定量检测免疫小鼠脾细胞IFN-r mRNA表达：免制备免疫小鼠脾细胞悬液，24孔板，每孔106个细胞。用5ug/ml蛋白刺激，。24h收集细胞上清, 疫小鼠脾细胞总RNA的提取一般提取RNA的方法提取RNA，等定样品的含量及纯度，-80℃保存备用；CDNA的合成；SYBR Green 实时定量PCR：24刺激物的收取利用实时定量的方法，检测免疫小鼠脾细胞中IFN-r mRNA 相对于B-actin mRNA表达量，进行相对定量分析。(92bp) ⑵利用双抗体夹心ELISA定量检测IFN-r分泌情况。 免制备免疫小鼠脾细胞悬液，24孔板，每孔106个细胞。用5ug/ml蛋白刺激，。72h收集细胞上清检测分泌水平。 ⑶流式细胞仪检测小鼠脾细胞内分泌CD8+，CD4+T水平 4、攻毒实验： 现存的问题是不知道如何确定攻毒的剂量,因为我们需要做在乳鼠上做LD50。如果不做的话，根据文献报道，用LD5010-8 ml-1 ,用104LD50,200ul.,病毒血症在36h达到最高。（文