基因克隆载体详解.pptxVIP

基因克隆载体 一、概念 克隆载体是一种能够携带外源DNA片段或基因进入受体细胞，并使其在受体细胞得以维持或表达的DNA分子。 载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 二、基因克隆载体必须具备的条件 1、容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 2、能携带外源DNA片段进入受体细胞自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制。 3、自身分子质量较小，拷贝数高。 4、必须带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 5、安全性。不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞。 随着分子生物学技术的发展,越来越多的克隆载体相继出现 ,这些载体的发展推动了结构基因组学和功能基因组学研究。同时随着人类基因组计划和植物基因组计划的实施 ,克隆载体的整体结构、克隆能力和转化效率等都有了长足的发展。可以把克隆载体的发展划分为三个阶段 : 三、基因克隆载体的发展阶段 第一阶段以质粒、λ噬菌体、柯斯质粒为主,主要特点是载体在宿主细胞内稳定遗传、易分离、转化效率高 ,但是克隆容量有限 ,一般小于 45kb 。 第二阶段的克隆载体则突破了上述载体容量,显著特点是载体的容载能力扩大,约100～350kb ,主要有酵母人工染色体、细菌人工染色体、以及源于噬菌体 P1的人工染色体。 第三个发展阶段是以近几年发展起来的双元细菌人工染色体(BIBAC)和可转化人工染色体(TAC),这些载体不仅具有较大的克隆容量 ,而且具备了直接转化植物进行功能互补实验的功能。 四、常用克隆载体 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 人工染色体载体 大片段双元载体 1、质粒载体 （1） 生物学特征: 质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。目前对大肠杆菌的质粒研究得比较深入。质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型质粒 1 - 3 拷贝 松弛型质粒 10 - 60 拷贝 （2）质粒的不亲和性： 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中。 亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒。 不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒 意义：受体细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒。 （3）质粒的可转移性： 是指在自然条件下，质粒可以通过细菌的接合作用转移到新宿主内，根据质粒的转移性，将质粒分为： 接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞，如F、Col、R质粒等。 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。 大肠杆菌接合 （4）迁移作用 某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，发生DNA转移的过程。 （5）携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。 （6）质粒的构建： 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 构建原则 ： 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选用合适的启动子 5、构建过程力求简单 （7）重要的大肠杆菌质粒载体： pBR322质粒载体： （1）较小的分子量，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA。 （2）带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。 （3）较高的拷贝数，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 （4）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。 pUC质粒载体： （1）分子量更小、拷贝数更高。 （2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时。 （3）装有多克隆位点（MCS），方便转移外源DNA在不同载体系列中穿梭，使具有两种不同粘末端的外源DNA能直接克隆入pUC载体。 （4）选择颜色标记 lacZ’，用于基因克隆和测序。 2、噬菌体载体 （1）定义 噬菌体是病毒的一种，其DNA能被开发成为基因工程的有用载体，高效的感染性能使外源基因高效导入受体细胞，自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。 噬菌体主主要有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类。 重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有双链的λ类噬菌体和单链的M13噬菌体。 （2