定量免疫实验.ppt

定量免疫实验 ——赵丽娅 一、原理 定量免疫实验的原理是基于抗原 - 抗体的反应。即抗原决定簇与抗体结合部位相结合，这种结合，这是由氢键，离子键，疏水相互作用，以及范德华力来实现的，它是一种平衡反应，符合质量相互作用定律。 由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。 二 、应用 在医疗诊断和研究中测定生物分子的浓度，例如，激素，细胞因子，和肿瘤标志物或者小的化学分子，可用于各种疾病的 诊断、疗效评价及发病机制的研究。免疫测定法的优点是它具有很高的灵敏度。测定的灵敏度ng 甚至pg水平。 三、常用方法 1、双抗体夹心法 将已知抗体结合在固相载体，加入待测的样品（抗原），再加入酶标抗体。最后再加入酶的显色底物与之反应显色。在测定时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 2、竞争法 小分子半抗原如地高辛、茶碱等因其只有一个抗原决定簇，可采用竞争抑制法测定。竞争法就是将待检抗原和标记的抗原竞争的 与固相的抗体结合，样品中抗原含量越多，结合在固相抗体上的酶标抗原就越少，显色越浅。以此便可以检测出未知抗原的量。 操作步骤 1）先用特异性抗体包被固相载体并封闭。 2）同时加入待测样本和酶标抗原小分子，孵育一定时间后洗板。 3）加入酶底物，孵育显色测定，显色的强弱与待测样本的小分子含量成反比， 检测限度 定义：检测限为最低抗原浓度，用统计学方法计算出的，最低的测量信号是一个显著偏离0的值。 方法：对应于标准曲线的零值，用10个起始抗原浓度的数值。计算它们的的算术平均值和它们的标准偏差。 选择方法的原则 每种方法都有优缺点，如何选择将取决于实验者的免疫测定的要求。关键参数是所需灵敏度，合适的时间，抗原的大小，标记的能力。 对于非常低的抗原浓度的标本，需要敏感性高的方法。夹心测定其理论最高敏感度为10-15 到10- 16 mo??l/l。竞争实验只有约10-14 mol/I。免疫测定的灵敏度，主要取决于抗体与抗原亲和力。 抗原的大小和结构也很重要。使用夹心测定法中，抗原 必须具备两个抗体结合位点，可以结合不同的两种抗体，小的半抗原不能用双抗体夹心法进行检测。 RIA放射免疫实验 放射免疫分析也称同位素标记技术。它是将同位素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性相结合的一种灵敏的检测方法。RIA法所用的标记标记物质是放射性核素，检测时需要特殊仪器检测放射量，以对待测物质进行定性、定量分析。 虽然放射免疫法，在许多领域被其他免疫测定法（ELISA法等）被替代，但它对于小分子的定量测定始终扮演一个重要的角色（如肽激素）。 放射免疫分析技术的原理为放射性标记的抗原（Ag*)和被测抗原Ag（或标准品）与有限的特异性抗体发生可逆的竞争结合反应，最终形成的放射性抗原-抗体复合物的量与被测物的含量成负相关。当被测抗原含量高时，对抗体的竞争结合能力就越强，Ag-Ab的形成量越多,Ag*-Ab的复合物就相对较少，反之，当待测抗原含量低时，对抗体的结合能力就弱，Ag*-Ab复合物的形成量就增多。 游离抗原与抗原抗体的分离 1、吸附游离的抗原 活性炭、滑石粉、硅酸盐、离子交换凝胶柱 2、沉淀抗原抗体复合物。 有机溶剂，硫酸铵，PEG 3、市售的固相分离的固相载体。 放射性的检测 放射活性可用闪烁计数器测定。此装置的原理是基于放射性同位素释放的放射性能量可转换为光子，其信号能够被检测到。光强度与核衰变释放的能量成正比。常用的测量仪器： 1、碘化钠晶体闪烁器。但采用晶体闪烁器的测量仪器不适合用于检测弱发射器如3H和14C。 2、液体闪烁计数器。它是一种或多种有机溶剂的混合物，可确保与含水试样好混匀。一个粒子的放射性衰变后的能量就转移到溶剂分子，使它变得活跃。这些溶剂分子的能量转移到荧光团分子。能量大约为365纳米范围内的光子的形式，可以检测荧光的强度与抗原或抗体的浓度呈负相关。 一些液体闪烁计数器不能检测短波，所以第二荧光团加入到混合液中。它由第一荧光团激发而发射更长波长的光，范围为约420纳米内 酶联免疫吸附实验（ELISA) 1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素