实验二+分子荧光光谱法2014.10.20.pptx

实验二 荧光光谱法 一、概述 1.1. 分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光。 在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法 分子在退激过程中以光辐射形式释放能量 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光 电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法 荧光—荧光分析法 磷光—磷光分析法 1.2. 分子荧光分析法的特点 灵敏度高 检测限荧光分析法比分光光度法低2~4个数量级， 检测范围10-8~10-10 g/mL 选择性好 荧光波长较长，比较容易排除其它物质的干扰 实验方法简单 待测样品用量少 二、荧光光谱法的基本原理 2.1 分子荧光的产生 Pauli不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。 电子激发的多重态：M=2s+1 单重态: 分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的, s=0,M=1 三重态：电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，s=1,M=3 2.1.1 分子能级与电子能级的多重性 2.1.2 分子荧光的产生 分子室温时处于电子能级的基态，当吸收光辐射后基态分子中电子只能跃迁激发单重态的各个不同的振动-转动能级，根据自旋禁阻选律，不能直接跃迁到激发三重态 各能级。 处于激发态的分子是不稳定的，通常以辐射跃迁和无辐射跃迁释放多余的能量而返回到基态，发射荧光是其中一条途径。 2.2.1 振动弛豫（vibrational relexation)：从电子激发态的某一振动能级到达同一电子激发态的最低振动能级的过程。 特点：发生在同一个激发态的电子能级上；时间约10-12秒。 2.2 分子发光的产生 2.2.2 内转换（internal conversion)：当两个电子的能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，电子常常由高能级以非辐射跃迁方式转移至低能级，这种过程也称为内部能量转换。 特点：两个电子的能级非常靠近以致其振动能级有重叠时内部转换易发生；10-13~10-1 秒可完成。 2.2.3 外部能量转换（external conversion)：在溶液中激发态分子与溶剂分子之间或其他分子的碰撞而失去能量，常以热能的方式放出，这个过程也称为外转换。 特点：发生在分子与分子的碰撞时；时间约10-9~10-7秒。 影响系间跨越的因素： ▲含重原子如碘、溴等的分子，体系间跨越最为常见。 ▲在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也能增加体系间跨越的发生几率。 2.2.5 荧光（Fluorescence)：电子由第一激发态单线态的最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而发射的光量子为荧光。 特点：荧光的能量小于所吸收的紫外光的能量，故发射荧光的波长比吸收的紫外光波长更长；时间约为10-9~10-7秒。 2.2.6 磷光（Phosphorescence)：由第一电子激发态三重态的最低振动能级跃迁到基态任一振动能级发射的光量子为磷光。 特点：磷光能量比荧光小，波长比荧光长；发射时间长，约为10-4~10秒（原因是分子激发三重态的寿命较长）。 处于激发态的分子或原子通过碰撞，以热能或动能的形式消耗其能量，降低到较低能级，这种能级的变化叫无辐射跃迁。 处于激发态的分子或原子通过发射出一定波长的光，以辐射的形式回到基态，这种能级的变化叫辐射跃迁 (光致发光) 2.3 无辐射跃迁与辐射跃迁 熄灭或猝灭 激发光去除后，荧光立即消失 激发光去除后，磷光不会立即消失 三、激发光谱和发射光谱 3.1 激发光谱（excitation spectrum) ： 不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长的荧光所得的光谱。即固定发射光波长λem，依次改变激发波长λex测荧光强度F，以F-λex作得荧光物质的激发光谱。 3.2 发射光谱（emission spectrum)又称为荧光光谱（fluorescence spectrum)： 即固定激发光波长λex，依次改变发射波长λem 测荧光强度F、以F- λem 作图得荧光光谱。 3.3 荧光光谱的特点 3.3.1. 斯托克斯位移（Stocks shift)：荧光发射波长总是大于激发光波长。 原因：激发态分子由于内部能量转换和振动驰豫过程而迅速到达S1*电子态的最低振动能级，从而存在着无辐射能量损失。 3.3 荧光光谱的特点 3.3.2. 荧光发射光谱的形状与激发波长无关。 原因：荧光发射发生于第一电子激发态的最低能级，与分子激发至那一个电子能级无关（即使分子激发到高于S1*的电子态的更高振动能级，可通过内转换和振