拟干酪乳杆菌胞内代谢产物的GC_MS分析方法的建立(精选).doc

拟干酪乳杆菌胞内代谢产物的GC- MS分析方法的建立 摘 要：用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术建立了拟干酪乳杆菌发酵过程中胞内代谢物的代谢组学研究方法。考察了不同溶解剂（吡啶、四氢呋喃、二甲基甲酰胺）和衍生化试剂（N-甲基叔丁基二甲基硅基三氟乙酰胺（MTBDSTFA）、N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰+三甲基氯硅烷（BSTFA+TMCS）、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）），对质谱峰的信号强度和个数的影响，确定使用吡啶作为溶解剂、BSTFA+TMCS作为衍生剂的两步衍生法效果最佳。以拟干酪乳杆菌为分析对象，共鉴定出38种胞内中间代谢物。方法学考察结果表明，该方法具有良好的精密度、稳定性和重现性。本方法已成功地应用于拟干酪乳杆菌发酵过程研究，并且发现了发酵过程中可能的生物标志物。 关键词：拟干酪乳杆菌，气相色谱-质谱法，代谢组学，主成分分析，发酵 Metabolites research of Lactobacillus paracasei with gas chromatography-mass spectrometry Abstract：A reliable metabolomics method for investigating intracellular metabolites in Lactobacillus paracasei by gas chromatography - mass spectrometry was developed . The effect of different solvents （ pyridine ， tetrahydrofuran and dimethylformamide），and derived reagents （MTBDSTFA，BSTFA+TMCS and MSTFA），for peak signal intensity and numbers were investigated. The best condition with pyridine as solvent and BSTFA+ TMCS as derived reagent was determined. Total 38 kinds of intracellular metabolites were identified in the samples of Lactobacillus paracasei. The method had been successfully employed in fermentation process study. Several biomarkers had been detected and identified． Key words：Lactobacillus paracasei；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；metabolomics；principal component analysis；fermentation 乳酸是最广泛存在的羟基酸，可以通过化学合 成或发酵生产 [1] ，其应用领域十分广泛，如食品，医 药，纺织，皮革化工等行业 [2] 。 代谢组学作为一门新兴的学科，被广泛应用在 各个领域，如微生物鉴定 、筛选 [3] ，突变体功能基因的 研究 [4-5] ，食品质量检测、食品产地来源鉴别 [6-7] ，此外， 其在微生物代谢工程领域也有广阔的应用 [8-9] ，是研 究菌体代谢状态、研究发酵过程和发现未知途径的 不可或缺的手段，有利于进一步开发新的生物工艺 过程 。代谢组学其研究对象大都是相对分子质量 1000 以内的小分子物质 [10-11] 。 GC-MS 因其高分辨率 、 高灵敏度的特点被广泛 应用于代谢组学研究 [6-7] 。GC-MS分析之前需要将待 分析物进行化学衍生化以提高挥发性和热稳定性。 硅烷化衍生剂具有很强的衍生能力，是最常用的衍 生化试剂 [12] 。此外，经常在烷化试剂中加入1%的三甲 基氯硅烷（trimethylehlorosilane，TMCS）作为催化剂。 本研究基于GC-MS技术建立了拟干酪乳杆菌发 酵过程中胞内代谢物的代谢组学研究方法，并将优 化的GC-MS方法用于拟干酪乳杆菌发酵过程研究。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 菌种 拟干酪乳杆菌（ Lactobacillus paracasei ）， 为实验室保藏菌株；溶解剂（吡啶 、二甲基甲酰胺、 四氢呋喃）和衍生剂（ MTBDSTFA、BSTFA +TMCS、 MSTFA ） Sigma ；表 1 所列 28 种标准品 上海源聚生 物科技有限公司；对氨基苯甲酸 Sigma。 GC-