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干血点采样和微透析技术在药动学研究中的应用 摘要：药动学研究过程中，传统的取样方法存在一定的缺陷，使新的方法应运而生，干血点采样技术和微透析技术就是其中两个。本文就它们的原理、目前在药动学方面的应用现状、优点与不足之处作概述。 关键词：干血点采样 微透析技术 药动学 进行药动学研究通常需要从生物体采集大量的全血（临床前试验每个时间点通常采集 100～500μl，临床试验 1～5 ml）以获得足够的血浆用于生物定量分析。应用传统的方法，在临床前试验中，每只动物只能获得一定体积的全血，如果用血量大，则需要将多只动物的血样混合，这往往导致药动学数据的可靠性下降，而且对动物的需求量增加。另外，血浆的处理要使用固相萃取、液液萃取或者蛋白沉淀等方法，这些步骤耗时耗力，限制了检测通量和样品检测数量。最后，血样的运输和储存也存在实质上的困难，运输以及储存过程需要冻存并妥善处理。由此可见，研究新的采样方法对药动学的研究有着不容忽视的意义。本文就两种非传统采样方法进行综述。 1.干血点采样技术 干血点采样（dried blood spot，DBS），即将全血样品收集在卡纸上，作为一种采集生物样品的新型替代技术，在血样采集方法上比传统方法有一定的优势。它需求较少的血量（通常小于 100 μL），可减少动物使用，方便血样采集、存储运输，简化样品前处理。特别适合小动物的连续样品采集。有关DBS样品采集、干燥、储存和运输、前处理等方面的综述如下： 1.1 DBS 样品采集方法 1.1.1 DBS 采样卡 FTA 和 FTA Elute 卡，可用于 DBS 采样，两种卡通过适宜的化学试剂处理后，具备溶解细胞，使蛋白变性，并且抑制细菌等其他微生物生长的功能。 1.1.2 DBS 样品采集过程 在临床前研究中，小动物（如小鼠、大鼠）可以从尾部采血。血样可直接滴到采样卡的圆圈内，应避免直接接触到卡纸，尤其是在采样前和血样未干燥前。还应避免凝血、分层以及过饱和等情况的发生。血样应均匀分布在圆圈内，采样卡两侧血样的颜色应保持一致。如果样品被污染，出现溶血现象或者采样体积不够，均为不合格的采样。也可以使用加样枪将血样点到采样卡上，这样可避免潜在的血细胞比容差异、采血量的影响、血样在采样卡上分布不均匀等采样错误。加样枪头应距离采样卡若干毫米，当血样碰触到卡时会迅速分散开，使血样在卡上分布均匀。 1.2 DBS 样品干燥、储存和运输方法 在储存和运输前将 DBS 样品充分干燥是十分重要的。一般而言，在室温开放环境（15～22 ℃）下，干燥时间至少为 2～3 h。干燥时间取决于采样卡的类型以及采血量的多少。样品不应该加热、重叠放置或者接触其他表面，需要的话应避免阳光直射。潮湿可能引起细菌生长，改变提取效率或者促进不稳定分析物的降解，从而导致血样的分析质量下降。因此在干燥之后，为避免 DBS 样品接触水分或湿气，可用纸覆盖 DBS 样品并装进含有干燥剂的封口袋里，另外，包装袋内应含有湿度指示剂。通过这种方式包装的 DBS 样品可在室温下储存数周至数年。如果样品含有不稳定的化合物，则应储存在低温环境（2～8 ℃、≤?15 ℃或≤?60 ℃）。按照上述方法包装的 DBS 样品可通过邮寄方式运输，在此期间不需考虑血样暴露或者传染性物质等问题。 1.3 DBS 样品前处理方法 1.3.1 打孔位置的选择 为考察全血在 DBS 卡上的分布情况，根据干血点的直径大小，选择中心及边缘位置打孔得到相同尺寸的滤纸片，处理后进行样品分析，随行标准曲线测定其浓度。研究表明，打孔位置会直接影响DBS 样品定量分析的结果。如果点卡体积小而打孔面积大，那么所测结果的精密度会比较好；如果点卡体积大而打孔面积小，那么所测结果的精密度会比较差，原因可能是卡纸成分的干扰。唯一能精确地对待测物进行定量分析的方法为点卡体积完全相同，从卡上取下所有的血点。 1.3.2 离线提取 在定量分析中，从 DBS 卡上打下一个或多个一定直径的圆片放入分析试管或 96 孔微量滴定盘中进行提取。提取时通常加入一定量的含有内标的提取溶剂（甲醇、乙腈或者一定比例的水-有机溶剂混合物）。选择合适的提取溶剂破坏基质或滤纸里分析物与蛋白的结合，并通过振荡或者涡旋等方式将分析物洗脱下来，涡旋时间一般为 20～60 s，必要时也可采用超声处理来提高提取效率。离心之后，提取物手动或自动转移到试管或微量滴定盘中直接进样，或者吹干后用流动相复溶进样。 1.3.3 在线提取 最近有报道关于 DBS 样品的在线提取方法。该方法基于“inox cell”结构，可以将滤纸片上的分析物洗脱下来，随即导入 LC-MS 系统，从滤纸上释出的分析物通过色谱分离后进入质谱检测。 1.4 样品稳定性 根据 DBS