第十七转基因育种技术素材.ppt

* * * * * * 植物的“转基因逃逸” 方式： 种苗的散失或残缺组织的再生，在野外形成自我繁衍的群体，形成转基因的逃逸群落； 通过花粉的传播，转基因的近缘物种漂流形成杂交的超级生物。 ◆ PCR反应包括三个步骤： ●变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。 ●复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60℃ ●延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链 ◆ 这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外快速扩增DNA的方法 PCR产物可以通过电泳检测 琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 特异性PCR检测外源基因整合到受体 转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的PCR扩增结果（M为分子量标准，C为非转基因植株，P为质粒对照，1-20为转基因植株） Southern杂交 Northern杂交 细胞原位杂交 常用的转基因生物分子检测手段有 四、核酸分子杂交技术检测转基因 转基因植物鉴定所涉及的核酸分子杂交有: Southern杂交是以已知DNA或RNA为探针，检测目标DNA的存在，用于外源目的基因整合的鉴定及分析。 Northern杂交是以已知DNA或RNA为探针，检测特异的mRNA分子的存在，用于外源目的基因转录产物（mRNA）的检测。 细胞原位杂交是一项组织化学与分子杂交相结合的技术，用来检测组织细胞内目标DNA或RNA分子存在位置，采用这一技术可以确定整合有外源基因 的染色体及外源基因在染色体上的位置。 另一类似的技术是Western蛋白质杂交，它是利用抗原与抗体特异结合的原理检测外源目的基因表达产物特异蛋白的生成。 * 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交：是指一条单链核酸分子（DNA或RNA）通过碱基互补与另一条单链核酸分子形成稳定双链的过程。 基本原理： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C ; 变性： 升高温度至94℃左右，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 缓慢降低温度（ 52℃左右），变性的两条单链重新形成 互补双链。 碱基互补: 1.Southern杂交(Southern blotting) ◆将DNA用限制性酶酶切→酶切DNA电泳→变性→转移到膜上→经过标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交→洗去膜上非特异性结合的探针→检测杂交信号 。 ◆如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。 此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。 带有DNA片段的凝胶 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA片段的膜 Southern 印迹杂交的技术流程 * Southern杂交进行基因诊断 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 kb 23.1- 9.4 - 6.6 - 4.4 - 2.3 - 2.0 - 转基因棉花的Southern杂交检测（M为分子量标准，1为阳性对照，2为阴性对照，3-8为转基因植株） * Southern原位杂交（确定外源基因在染色体上的位置） Northern杂交是一种RNA-DNA杂交。 将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上； 将它们原位转移到固相膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交； 然后通过探针的标记性质检出杂交体。 2.Northern杂交 3.Western杂交 在证明外源基因表达出特异的mRNA后，还需要进一步证明表达出的mRNA能翻译成特异蛋白质。 若外源基因的表达产物是一种酶，则可以通过测定转化植株中该酶活性来达到检测该外源基因的表达情况之目的。 若表达产物不是酶，就要采用免疫学方法检测。 鉴定转移的目的基因、选择标记基因是否表达。 观察是否发生外源基因以外的变异。转基因生物还可能因为细胞培养或T-DNA的插入而造成其它性状的突变。最好选出其它性状均未改变而仅产生目的基因性