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苹果酸的分离与分析1500字 苹果酸的酶法制备 一、苹果酸的酶法制备 （一）苹果酸生产 1、苹果酸生产机理 L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。理论上讲，补充4碳酸的途径有两条：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。 2、苹果酸生产用微生物 不同的苹果酸发酵工艺要采用不同的微生物。一步法发酵工艺采用的微生物有黄曲霉、米曲霉和寄生曲菌；两步法及混合发酵法采用的有华根霉、无根根霉、短乳杆霉、膜醭毕赤酵母等；酶法转化有短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌和黄色短杆菌等。 3、苹果酸发酵工艺 L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型。 （一）酶法转化工艺 酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸；而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸（盐）。如果转化是以钙盐的形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体。 延胡索酸酶 +H2O 延胡索酸（反丁烯二酸） 苹果酸（2－羟基丁二酸） 富马酸酶活力短乳杆菌和德氏乳杆菌较好。短乳杆菌在等体积的麦芽汁和肉汤加l0 g/LCaCO3的培养基，于pH 6和37培养3天，作为富马酸酶的来源。 上述用干细胞作为酶制剂的效果虽然很好，但从实际生产观点出发，如果不需要分离细菌细胞，而将底物直接加入短乳杆菌培养液中将是更为方便和经济适用的。 （二）固定化细胞转化工艺 富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反应，因此只要把富马酸酶提取出来，固定到载体上，就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。但实际上酶的提纯手续复杂， 酶的回收率低，成本高。 固定细胞法与固定酶法相比，具有下述优点： A、不需要进行酶的抽提和纯化； B、与酶提纯过程相比，细胞固定过程中酶活力的保存率较高； C、酶的光学活性较高； D、成本低 但是，固定化细胞的缺点是有副反应存在，特别是易于生成琥珀酸，这在产品中很难与苹果酸分离。幸运的是，细胞固定之后采用一些化学试剂处理可以排除上述副反应。 1、产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产 产氨短杆菌是用于固定化细胞生产L-苹果酸的最好菌种之一，下面以产氨短杆菌为例介绍固定化细胞生产方法。 产氨短杆菌培养基（%）： 葡萄糖 2 富马酸0.5 玉米浆 1 尿素0.2 KH2PO4 0.2 MgSO4?7H2O 0.05 pH7.0 细胞在30，好氧培养20～24h后，用高速离心机收离菌体，再将细胞悬浮于生理盐水中，再用聚丙烯酰胺凝胶包埋，方法如下： 对于16mL悬浮液，加入丙烯酰胺3g，N，N`-甲叉丙烯酰胺0.16g，5%β-二甲基胺丙腈水溶液2mL及1%过硫酸钾水溶液2.0mL，于25静置10min。将形成的凝胶切成3mm大小的小块。 这种制备好的固定细胞直接使用会有副反应，产生琥珀酸，它在产品中很难与苹果酸分离。工业上，胆汁处理法最为适用。 将固定化产氨短杆菌凝胶块装到酶反应柱中进行连续操作的情况下，当lmo1/Ll的富马酸钠溶液（pH7.0）以0.25h-的稀释速率流过反应柱时，在37 稳定状态下约有80%富马酸转化成了L-苹果酸。固定化细胞反应柱的富马酸酶稳定性与操作温度有关。采用37操作温度，反应柱的半衰期约为55天。 2、黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产 黄色短杆菌等富马酸酶活力较高。上述细菌细胞用卡拉胶固定效果更好。卡拉胶也称角叉菜胶，固定方法如下： 8g（湿重）黄色短杆菌细胞悬浮在8mL生理盐水（45）中，将1.5g卡拉胶溶在34mL生理盐水中，两者在约50混合，冷至约l0维持30min。为了增加凝胶强度，再将它浸在250mLl0.3mol/L的KCl溶液中，在10维持4 h。这样处理以后，用刀将形成的较坚硬凝胶切成3mm大小的小块。为了增加富马酸酶活力和抑制琥珀酸生成，固定后的凝胶块要用含0.3%胆汁和1mol/L富马酸钠的溶液，于37下静浸20h。 3、酵母细胞固定与苹果酸生产 （1）材料 活化的酵母细胞、0.05%的CaCl2溶液、海藻酸钠溶液。 （2）操作步骤 1）海藻酸钠溶液配制 取0.7g海