实验八感受态细胞的制备和转化.pptVIP

实验八 感受态细胞的制备和转化 一、实验目的 1、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2、学习用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 3、学习外源DNA转化大肠杆菌受体细胞的方法。 二、实验原理 转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株 Rˉ，Mˉ ，这些变异株可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 受体细胞经过一些化学试剂如CaCl2、 RbCl等处理后，细胞膜的通透性会发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 三、实验材料 E. coli DH5α菌株： R-，M-，Amp- 实验七的连接产物（pET32 和 PCR产物） 四、试剂 1、含Amp的LB固体培养基 2、0.05 mol/L CaCl2溶液 五、实验步骤 1、受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600 0.5左右。 2、感受态细胞的制备 （ CaCl2 法） 吸取1.5mL培养液到一灭菌的离心管中，将离心管插入冰中放置10min，然后于4℃下10 000 rpm离心10min。 弃去上清，用1mL预冷的0.05mol/L CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞，将离心管插入冰中放置30min，4℃下10 000rpm离心10min。 弃去上清，加入100 μl预冷的0.05mol/L CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰中放置几分钟，即成感受态细胞。 3、连接产物的转化 向制备的感受态细胞中加入10μl连接产物，轻轻摇匀，插入冰中，放置30min。 一位同学 向制备的感受态细胞中加入1μl连接产物，轻轻摇匀，插入冰中，放置30min。（另一位同学） 含有混合物的离心管置入42℃水浴中热击90秒，热击后迅速插入冰中，冷却3-5min。 向离心管中加入900 μl LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因 Ampr 。 4、转化产物的涂布 取500 μl复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃过夜培养。 同时做一个对照: 对照组： 以同体积的无菌双蒸水代替连接产物，其它操作与上面 相同。此组正常情况下在含Amp的LB平板上应没有菌 落出现。