Chapter 5 梯度洗脱1.pptVIP

液相色谱基础 梯度洗脱 目录 梯度的定义 梯度系统 “高压混合”HPLC系统 “低压混合”HPLC系统 梯度延迟或死体积 流动相的选择 最佳的色谱条件 梯度洗脱常见的问题 梯度的定义 流动相的组成或流速随洗脱时间的变化而变化 起始为弱洗脱能力的溶剂，随着时间的推移逐步变为洗脱能力较强的溶剂 惯例 A通常是洗脱能力较弱的溶剂或者流动相 B通常是洗脱能力较强的溶剂或者流动相 为什么要进行梯度洗脱？ 样品在色谱柱上有宽范围的保留 能够增加峰容量，更好的对复杂包含多种物质的组分进行强有力的分离 使峰形变窄 单位时间内的分离能力增加，有效的缩短分析时间 梯度洗脱系统的类型 “高压”系统 溶剂混合处在泵的高压一侧，即混合点处于泵头之后 “低压”系统 溶剂混合处在泵的低压一侧，即混合点处于泵头之前 “高压”梯度系统 优点 系统体积小 没有严格的在线脱气机要求 缺点 一个泵只能控制一路溶剂 最多仅允许三路溶剂（通常二路） “低压”梯度系统 优点 只需一个泵头 同时使用多种溶剂 （通常不超过四种） 缺点 较大的系统体积 需要在线脱气 梯度滞后体积与死体积 梯度方法转化实例 了解滞后体积的重要性 当梯度方法从一个色谱系统上转化到另外一个色谱系统上时，滞后体积的不同能够改变保留时间和分离度 需要对不同系统的滞后体积进行确定 当进行梯度梯度方法开发时，要考虑不同系统的滞后体积的不同，这样才能更加容易的在不同系统上进行梯度方法的转换 梯度洗脱时的溶剂选择 A（弱洗脱溶剂）溶剂的洗脱能力应该尽量的小，这样才能够使最快洗脱的物质有一个很合理的保留（K1） B（强洗脱溶剂）溶剂的洗脱能力应该非常的强，这样才能够使最晚出峰的物质有一个合理的保留（K20） A和B应该能够非常好的混合 A和B应该尽量的没有粘滞性 水与有机溶剂混合时的粘度 梯度洗脱时的注意事项 平衡时间 流动相的兼容性 要求高纯度的流动相（包括水）以及各种添加剂 通常需要进行空白梯度实验 当估算色谱分析时间时，需要回到起始比例重新平衡色谱柱 重现性 色谱参数的优化 起始比例 结束比例 梯度分析时间 总运行时间 曲线类型 梯度类型（二元，三元，四元） 流速 常规的梯度起始比例 在15到25分钟内，B流动相从10变到100% 流速为1-2ml/min 选择合适的起始比例（B%）和结束比例，梯度时间，流速 优化实例 增加B的起始比例 优化实例 增加B的起始比例并且进行梯度分割 梯度洗脱的问题 总结 理解HPLC的滞后体积和系统死体积 进行梯度空白实验，检查流动相中是否含有的其它杂质 确保足够的时间返回到起始比例并且重新平衡色谱柱 使用高纯度的流动相（HPLC级） ?2009 Waters Corporation * ?2009 Waters Corporation ?2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL * ?2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 二元梯度系统，在高压侧混合 “高压混合” “低压”混合 死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时) 滞后(系统)体积 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 比例阀 检测器 进样器 A B C D 色谱柱 溶剂输送系统(泵) 阻尼器 混合器 新系统 1ml (Waters 2695650ul) 较早的系统一般都是几个ml 滞后体积不同，保留时间改变，分离度改变 滞后体积大 滞后体积小 当色谱柱初始使用纯水平衡时，水中的有机物将在色谱柱上富集，随着梯度变化时，有机物将被洗脱出来 ?2009 Waters Corporation *