重点2.pptVIP

二、Northern印迹 原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上。经过杂交，分析mRNA的大小及含量。 应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。 方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗膜→压片→洗片→图像分析。 第一节 概述 (Introduction) 1. 影响自身基因表达活性的DNA序列 2. 非编码序列 3. 分启动子、增强子、沉默子 启动子： 是指RNA聚合酶结合并起动转录的DNA序列 核心启动子元件(core promoter element) ，TATA盒，-25bp 上游启动子元件(upstream promotor elements,UPE)，CAAT 盒，-75bp；GC序列等 特点 1。近侧端元件 2。具有距离性 2。具有明显的方向性 3。RNA聚合酶的结合位点 2. 增强子： 远离转录起始点（1~30kb），增强启动子转录活性DNA序列，与方向、距离无关 ①增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离起作用（无距离性）。 ②增强子的作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用 （无方向性）。 ③增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。　　 ④增强子必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性。 3. 沉默子：负性调节元件，起阻遏作用 沉寂子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。 （二）反式作用因子(trans-acting factor) 概念：为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放（正调控）或关闭（负调控） 通用转录因子—结合在TATA盒上的蛋白质因子。 TFⅡA、 TFⅡB、 TFⅡD、 TFⅡE等 转录调控因子—结合在UPE上的蛋白质因子 * * * * 第三章 核酸分子杂交技术第一节 核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。 杂交有固一液相杂交和液相杂交。 分子杂交的过程 (一)印迹： 待测的DNA/RNA转移到固相支持物上的过程。 Southern印迹：把DNA转移到固相支持物上的过程。 Northern印迹：把RNA转移到固相支持物上的过程。 Southern blot（Southern印迹） 提取基因组DNA 定量：1 OD260=50 μgDNA 酶切 进行1%琼脂糖凝胶电泳 变性：NaOH 中和：Tris.cl （pH 8.0）中和强碱 转移到固相支持物上 虹吸法 电转移法 真空转移法 干燥：NC膜 （80 ℃真空干烤2 h） 尼龙膜：干烤/紫外线照射大于30 min 4 ℃保存备用。 正常人 病人 2、RNA定量 定量：1 OD260=40 μgRNA 纯度：OD260/OD280 1.8 完整性：电泳检查，判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。 完整 部分降解 全部降解 28s 18s 5s 1、提取RNA（后面详述） 3、变性电泳 1%琼脂糖甲醛变性电泳： 1%琼脂糖30 ml，60 ℃时加入1.62 ml甲醛原液（37%），再加入EB，灌胶，走电泳。 甲醛可使RNA局部的双链打开,二极结构解体,泳动时严格按照分子质量大小分级. 4、转膜（同上） 5、固定（同上） 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。 Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA 3‘末端标记法 标记的是双链，不破坏完整性。 （酶切后必须是3’凹陷） P P P ~ ~ α β γ 5‘末端标记法 5‘ 3‘ 3