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第三章? DNA的体外重组 第一节 DNA重组简介 重组DNA技术作为一个工具是建立在以下三个关键步骤的基础上： 第一是需要限制性内切酶在特定的位点切割外源DNA。 第二是将分离出的DNA片段与作为载体的第二个DNA连接。用重组的质粒转化宿主菌，获得含有重组DNA的转化体。然后对转化体进行培养，对重组DNA进行扩增。 第三是有能力鉴别出含有重组DNA的质粒克隆，这可利用DNA杂化技术来实现。重组DNA的复制（克隆）可以制造出成千上万的感兴趣基因的拷贝，而且如果基因被表达，可以生产出亿万个产物的拷贝。 2、在特定位点切割DNA 用同一种酶限制性内切酶切割外源DNA和质粒载体。 3、连接DNA片段 利用连接酶将从外源DNA获得的靶DNA与经同一种酶切割的质粒载体连接，构建成一个含有靶DNA的重组DNA分子，也称之重组质粒。 4、将重组质粒导入 合适的宿主细胞 为了使重组DNA分子增殖，必须将它导入合适的宿主菌，通过细菌的繁殖，才能获得重组质粒的克隆。外源DNA分子导入宿主细胞时，如果是直接导入称为转化；如果是利用一个病毒作为运载工具导入称为转染。 5、重组DNA在宿主细胞内大量复制 转化的效率一般都比较低，只有少量的宿主细胞吸纳了重组质粒。由于通常载体都含有抗生素抗性基因，例如插入到质粒中的氨卞青霉素抗性基因Ampr，经在含有氨卞青霉素培养基上培养，含有重组质粒或含有原来质粒（质粒自环化）的宿主菌大量繁殖，使得插入的DNA被大量复制。 6、筛选和鉴别含有重组DNA的宿主细胞 这是基因重组的最后一道工序要从转化菌中筛选含有重组DNA的菌落并鉴定重组子的正确性。通常载体都含有有助于鉴别含有重组质粒细胞的遗传标记，有的载体含有特异的DNA序列。筛选和鉴别转化的或转染的细胞一般都涉及到遗传选择和使用探针进行的核酸杂交。如果是表达载体还要进行连接方向和表达产物的鉴定。 第二节 重要的工具酶 DNA重组技术的建立首先依赖于能够用于切割、连接DNA、复制DNA和反转录RNA的酶的发现。 如DNA聚合酶、反转录酶、限制性内切酶和DNA连接酶等。 一、限制性内切酶（Endonucleosase） 20世纪50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护。 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实验室常用的有二十种。 限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点—分子手术刀。 （一）限制性核酸内切酶的分类 I类 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别位点附近切割双链，但切割序列没有专一性； II类 识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断； III类 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 在DNA重组中使用的限制酶主要是Ⅱ型限制酶。由于它能识别DNA分子上特定的核苷酸序列并在特定的位点切割，这样选择合适的限制酶，切割染色体DNA，建立一个DNA文库以克隆感兴趣的DNA片段就成为可能。 （二）II类限制性内切酶的命名及特性 命名原则： 取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I， II， III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。 II类限制性内切酶命名举例： Hind III从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶。 EcoR I表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。 （三）II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4，5，6碱基对，这些碱基对的顺序呈回文结构（Palindromic），而且切点就在其内部。 限制性内切酶识别特殊的DNA序列 如EcoRI ： 5-GAATTC- 3 3-CTTAAG- 5 分子刀-DNA限制性内切酶 DNA被限制性内切酶切开之后，呈现两种断口： 钝端（平端）如Pvu II, Alu I, EcoR V等； 粘端（粘性末端）如：EcoR I，Hind III，BamH I等 限制性内切酶产生的粘性末端 （四）识别位点在DNA分子中的频率 对于特定的限